西奈山研究人员开发了健康人诱导多能干细胞资源库

来自临床健康人类受试者的充分表征的人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 资源库可以作为体外人类发育、疾病建模、基因型-表型关联研究和药物反应评估的正常对照的重要资源。

该库涉及hiPSC 系的性别平衡、种族/民族多样化库的生成和广泛表征,这些资原来自 40 名年龄在 22 至 61 岁之间的临床健康人类个体。资源库为每个个体的一个 hiPSC 克隆提供全基因组测序数据、基因组血统确定以及疾病基因和风险分析等。这种广泛的表征使这个 hiPSC 库成为许多人类生物学研究的宝贵资源。

近期西奈山医学院的研究人员发表在Stem Cell Reports的一篇题为

A library of induced pluripotent stem cells from clinically well-characterized, diverse healthy human individuals的文章报道上述内容。

西奈山研究人员开发了健康人诱导多能干细胞资源库

A library of induced pluripotent stem cells from clinically well-characterized, diverse healthy human individuals(来自临床特征明确的多样化健康人类个体的诱导多能干细胞资源库)

自从诱导多能干细胞(iPSC)的开创性发现以来,人类诱导多能干细胞 (hiPSCs) 和从它们分化的细胞已经成为一种强大的体外人类模型系统。表型、疾病病因和机制、基因型-表型相关性和药物反应。然而,此类研究经常受到用于比较分析的少量 hiPSC 系或各自对照、报告的衍生 hiPSC 的体细胞变异性和分化细胞的异质性的阻碍。近年来,多个科研小组报告了建立各种 hiPSC 系数量范围广泛的 hiPSC 资源库。

这些资源库主要包括疾病特异性 hiPSC 和对照。对照 hiPSC 系来自没有研究过特定疾病的受试者,无论是亲属还是非相关个体,他们自称健康,或没有病史。然而,在这些研究中,没有明确进行临床健康评估,也没有报告健康状况的官方文件。尽管如此,此类文库已被用于研究与复杂基因组特征和表型相关的遗传变异如何驱动 hiPSC 及其分化细胞的分子和生理变异。

更大规模的比较和有效的疾病建模、药物发现和评估以及基因型-表型关联研究受到来自不同种族和民族背景和年龄的临床筛选的健康个体的 hiPSC 系的有限可用性和包含的影响。

在这里,作为 NIH-基于综合网络的细胞特征 (LINCS) 计划的共同基金项目的一部分,报告了从 40 个不同种族/民族背景的选定个人中创建的 hiPSC 库,以及通过严格的临床健康评估的年龄。

该库提供了 hiPSC 来源的每个参与者的临床特征、细胞遗传学报告、短串联重复 (STR) 验证和所有 40 个 hiPSC 系的多能性分析,以及全基因组测序数据、基因组祖先确定和孟德尔疾病基因和风险评估。

几项研究表明供体细胞来源、已建立的 hiPSC 的细胞异质性以及性别对细胞分化和生理行为的影响。分化的 hiPSC 缺乏细胞同质性可能会影响测量的生理参数的变异性。然而,尚不清楚从同一健康受试者的多个 hiPSC 克隆分化而来的细胞是否会在生理上表现相同。因此,该库研究了从来自同一个体的独立 hiPSC 克隆和来自不同个体的 hiPSC 克隆分化出来的心室和心房心肌细胞 (CMs) 的特征。

总之,我们来自 40 名临床特征良好的健康人类个体的多样化 hiPSC 库为科学界的各种生物医学和药理学研究提供了宝贵的资源。

hiPSC资源库的建立

潜在的健康志愿者是通过机构审查委员会 (IRB) 批准的广告招募的,并经过预筛选以可能纳入研究。96 名满足初始预筛选同意的男性和女性,并通过登记问卷记录了他们的性别、年龄和种族/民族。85 人接受了筛选研究医师的正式和彻底评估。

正式筛查涉及完整的病史;测量体重、身高、腰围和臀围、心率、血压、呼吸频率和氧饱和度;体检;和心电图 (ECG)。抽取血液用于分析临床相关参数。对女性参与者进行了妊娠试验。所有抽血和妊娠试验都被送到经过认证的临床实验室进行分析。

西奈山研究人员开发了健康人诱导多能干细胞资源库

 

图 1A)

 

超过 20 条排除标准包括心电图异常、任何心血管疾病家族史(不包括年龄小于 50 岁的一级或二级亲属的高血压)、任何一级或二级亲属的非缺血性心肌病家族史任何年龄、既往器官移植史、HIV 阳性状态、肌病史、肥胖、肾功能损害、自身免疫性疾病、包括脑钠肽在内的血液检测结果异常、体重指数≥30 kg/m2、终生吸烟 >2 包-年,或体检异常。将数据输入临床报告表,然后由两名资深研究医师(J.C.K. 和 D.T.)和筛选研究医师达成共识,对研究资格进行最终评估。

如果资格获得批准,受试者随后接受皮肤活检并正式成为纳入研究的受试者之一。在接受筛选的 85 名受试者中,42 名 (48.3%) 被认为符合最终纳入条件。总结了筛选对象被排除在进一步参与之外的原因。在 42 名符合条件的个体中,计划对 40 名进行皮肤活检。

hiPSC资源库的重要价值

诱导多能干细胞 (iPSC) 的引入开辟了个性化细胞疗法的潜力,并为再生医学、疾病建模、基于 iPSC 的药物发现和毒性评估带来了新机遇。

自 2006 年 Shinya Yamanaka 及其同事 产生诱导多能干细胞 (iPSC) 以来,人们对利用这些非凡细胞的全部潜力越来越感兴趣。在培养中,iPSC 能够自我更新并从所有三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)分化为任何细胞类型,重要的是,iPSC 的使用避免了与胚胎干细胞相关的伦理问题。此外,iPSC 技术的发展允许几乎无限量的健康或疾病特异性人类多能干细胞。在使用原代的、患者来源的受疾病影响的细胞类型时,获得此类细胞是一个主要障碍,这些细胞类型代表了疾病建模的“金标准”。由于这些特性,iPSC 在生物医学研究和开发中具有广阔的应用前景。

iPSCs在培养中的自我更新特性允许使用来自供体的健康和患病细胞系进行广泛的研究。已经产生了多个患病的 iPSC 系,允许研究目前难以在动物模型中获得的人类疾病表型,使 iPSC 成为用于药物筛选和毒性研究、药物开发、人类疾病建模、个性化医疗和细胞的有吸引力的选择。

据估计,分别有 27%、14% 和 7% 的药物由于对心脏、肝脏和中枢/外周神经系统的不良影响而在临床试验中失败。这部分是由于使用动物模型进行药物筛选,而这些模型无法很好地复制人体系统 。

使用人类 iPSC 进行药物筛选可避免在将其用于临床试验之前的跨物种差异。这不仅大大减少了药物筛选研究中使用的动物数量,还提高了临床试验的成功率。因此,来自健康和患病患者的 iPSC 作为药物筛选和毒性研究的首选细胞越来越受到关注。

最近,有研究表明,肌萎缩侧索硬化患者 iPSC 衍生的运动神经元表现出过度兴奋并降低培养中的存活率。研究人员表明,这可以通过已经获得 FDA 批准的钾通道激动剂来纠正,允许该药物直接进入治疗肌萎缩侧索硬化症的 II 期临床试验,而无需进行动物研究 。许多其他药物筛选研究可用于帕金森病、色素性视网膜炎和肺动脉高压等疾病。

近年来,研究人员将 iPSC 从实验室带到了临床。iPSC 在再生医学中的使用为该技术的临床转化提供了一个令人兴奋的机会,即生成患者特异性 iPSC 用于自体移植以修复或替换受损组织。

为了促进日本基于 iPSC 的研究和临床治疗,CiRA 被选为主要中心,开展“再生医学 iPSC 股票开发项目”。庆应义塾大学、CiRA、RIKEN 和大阪大学充当临床应用研究中心,旨在促进基于 iPSC 的细胞治疗 。

2014年,RIKEN通过移植iPSC来源的视网膜色素上皮细胞进行了iPSC移植治疗黄斑变性的首次临床试验。结果,没有观察到进一步的黄斑变性,患者报告视力有所改善。此外,京都大学/CiRA 的 Takahashi 教授及其同事成功地将 iPSC 衍生的多巴胺能神经元植入帕金森病患者的大脑。这是首个使用 iPSC 治疗帕金森病的临床试验。Takahaski 报告说,患者恢复良好,如果没有出现并发症,他们计划再治疗 6 名患者 。此外,大阪大学的 Sawa 博士和他的团队获得了将 iPSC 衍生的心脏细胞片植入三名心力衰竭患者的批准。最近,日本政府卫生部已批准庆应义塾大学医学院的冈野博士及其同事将 iPSC 衍生的神经细胞注射到四名脊髓损伤患者体内。尽管这些研究仍处于起步阶段,但使用 iPSC 的再生医学和细胞替代疗法可能很快就会得到更广泛的应用。

全球当前的 iPSC 资源库比较

欧洲诱导多能干细胞银行 (EBiSC)

EBiSC 于 2014 年与欧洲的多个公共和私人组织合作启动了其热启动项目。Babraham Research Campus 位于英国剑桥,是负责细胞扩增、QC 和表征的主要设施。同样位于英国的英国公共卫生部的欧洲认证细胞培养物收藏中心 (ECACC) 是向全球用户提供细胞储存和分发的主要银行,而位于德国萨尔布吕肯的 Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik (IBMT) 是一面镜子ECACC 的存储库 。

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凭借多年的经验,EBiSC 以其严格的标准化管道而闻名,并为未来 iPSC 银行的举措奠定了良好的基础。在收到捐赠者样本并附上捐赠者同意书后,将进行病原体/基因检测。一旦通过,工作流程将继续进行 iPSC 生成、存放和分发。为了确保所有中央或辅助设施在处理细胞时执行相同的程序,已经建立了文本和视频格式的标准协议。还举办常规培训课程,以确保机构间的一致性。

 

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EBiSC 的工作流程

iPSC 生成完成后,将进行一系列表征分析以研究支原体和细菌的不育性、使用流动分析和/或肉眼观察的细胞表型、染色体稳定性(通过 G 显带进行核型)、遗传同一性(STR 分析)、和多能潜能(三胚层分化)。特别值得注意的是,EBiSC 计划引入新的表征技术,例如自动成像以代替肉眼观察非整倍体,以及使用 KaryoLite BoBs 代替传统的 G 带,因为它易于解释 KaryoLite BoBs 结果并且是一种快速方法检测非整倍体。他们还计划使用 TaqMan 阵列板来评估多能性,目的是提高表征效率。

标准化程序的银行细胞可以保证 iPSC 更一致的高质量和解冻后存活率。EBiSC 绘制了细胞库 [50] 的详细过程,类似于上面提到的表征方法。其他银行流程包括在不含抗生素的培养基中培养细胞 3 次传代和随后的检测,以验证细胞不含任何重编程载体。

每个细胞系平均生成 50 个小瓶。大约 90% 的小瓶存放在 ECACC,10% 存放在 Roslin Cell Sciences 和 IBMT 作为备份。为了跟踪当前的分配状态,实施了 Item TRACKER 软件来定位单个小瓶并增强小瓶的可追溯性。为了改善机构间的沟通和管理,EBiSC 开发了信息管理系统 (IMS) 来记录细胞系信息和状态。用户也可以使用IMS在线目录,请求每个细胞系的数据包,并通过电子商务工具订购,从ECACC获取细胞。IMS 设计优雅,还可用作来自各种来源的用户生成数据的集成平台。

跨机构转移 iPSC 小瓶需要清晰的注释和完整标记的系统。EBiSC 为标记和识别细胞制定了自己的规则,提供诸如保藏者来源、iPSC 系、供体、克隆和亚克隆编号等信息。标签还包括批次/目录号和二维二维码。每个代码都分配给一个特定的细胞 ID,并与现有的自动冷冻设备兼容。

管道自动化是所有 iPSC 银行的未来目标。结合人工智能的机械臂,可以及时精确监测细胞形态和融合度,并通过完全相同的内置程序对细胞进行操作。这可以大大提高实验批次之间的可重复性并减少劳动密集型活动。EBiSC 通过在 IBMT 的细胞库中建立自动冷冻保存系统来引领自动化基础设施。其他系统正在开发中,包括 Babraham 研究园区的系统,旨在实现细胞培养和扩增的自动化。

台湾人类疾病 iPSC 联盟

台湾科技部于2015年成立,由5个实验室组成台湾人类疾病iPSC联盟,其中4个iPSC核心位于中央研究院生物医学研究所(IBMS)、台湾大学医院、台北退伍军人综合医院和国家卫生研究院(2015-2017)。这些核心是负责 iPSC 生成和分化为不同细胞类型(如心肌细胞和视网膜色素上皮细胞)的主要设施,而食品工业研究与开发研究所 (FIRDI) 负责细胞扩增、QC、表征和细胞库。IBMS自2015年以来一直是该联盟的领导者和主要管理机构。2019年6月,FIRDI将iPSC表征的职责转移到IBMS,因此FIRDI现在只负责细胞银行。

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台湾人类疾病 iPSC 联盟的工作流程

签署知情同意书后,从捐赠者身上抽取样本;然后将它们冷冻保存在合作医院中。所有捐赠者样本都使用脱链编号进行编码;但是,提供了其他捐助者信息,例如年龄、性别和特定的基因突变。除此信息外,不包括所有其他个人信息。收到后,对供体样本进行测试以确认它们不含支原体,此时,在 iPSC 核心使用仙台病毒生成 iPSC。此外,另外 10 mL 的血液样本被送到 FIRDI 的一个集中表征核心,在那里进行染色体完整性测试。每个捐赠者的样本有大约 6 到 10 个额外的小瓶,在液氮中冷冻保存,每个小瓶包含 2 × 106 个细胞作为 iPSC 核心设施的备份。为确认不同 iPSC 核心一致遵循标准化操作协议,在核心设施和核心间设施内举办例行培训课程,每个 iPSC 核心的所有一线工作人员每隔一个月举行一次实验室会议。

生成后,iPSC 将保持 8 代,此时收集 RNA 并使用 RT-PCR 测试仙台病毒的存在。对于每个 iPSC 系,选择三个仙台无病毒克隆,从依赖饲养层的培养系统(灭活的小鼠胚胎成纤维细胞)转移到无饲养层的培养系统。每个 iPSC 克隆大约有 10 瓶被冷冻并储存在 iPSC Core 的工作细胞库中。然后将无病毒 iPSC 运送到 FIRDI 进行 iPSC 表征,在那里测试 iPSC 系的冻融活力。

每个克隆都使用标准化程序在生物资源收集和研究中心 (BCRC) 的主细胞库中进行扩增和冷冻保存。一小瓶 iPSC 被解冻、膨胀,然后进一步冷冻保存到 10 个小瓶的工作细胞库中。随后,对从工作细胞库解冻的 iPSC 进行一系列表征分析。iPSC 表征分析用于 QA,其中包括多能潜能测试(胚胎体形成和畸胎瘤形成)和 iPSC 鉴定(RT-PCR、免疫荧光和流式细胞术)。质量控制检测包括无菌检测(检测支原体、细菌和真菌的存在)、遗传同一性(STR-PCR 分析)和染色体完整性(通过 G 显带进行核型分析)。

此外,进行全基因组单核苷酸多态性 (SNP) 阵列 (Affymetrix Genome-Wide SNP Array 6.0) 以识别在这些 iPSC 中由重编程过程引起的遗传变异(例如拷贝数变异 (CNV)、SNP 或丢失)杂合性)。完成 QA/QC 检测后,将为每个细胞系生成一份分析证书。为确保在各研究所之间易于分发,使用条形码注释系统来标记所有细胞系。有关生成的 iPSC 的信息以及完整的分析证书,可在 BCRC 的网站上获得,供台湾研究人员使用。

发布者:木木夕,转转请注明出处:https://www.cells88.com/gxb/7378.html

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