如何获取可靠的外泌体?

外泌体为何物?相信看过外泌体科普文的童鞋们都已经很熟悉了,在此小编就不再赘述,这里主要针对外泌体的进展及获取两方面谈谈个人观点。

在刚刚过去的2020年,尽管科学研究受新冠疫情影响,但外泌体研究领域仍然取得了诸多进展。据统计,在基础研究方面,2020年外泌体领域发表文献约4000多篇,较2019年发表数量增长27%;在药物开发领域,相比于细胞疗法,外泌体治疗独特的优势为当前一些难治疾病的治疗或者难以成药靶点的药物开发带来一些新的机会。

一方面,外泌体代替细胞治疗,避免了细胞治疗带来的免疫排斥和致瘤争议;另一方面,外泌体膜表面组织特异性抗原的表达为器官、组织、细胞靶向性的药物开发提供了生物学基础。复杂的膜组分可以让外泌体通过表面的蛋白相互作用,或者进入靶细胞来发挥作用,这使得药物的作用方式更加多元化。另外,外泌体的免疫原性很低,可以重复给药,且外泌体可以无创性地通过许多组织屏障(例如血脑屏障等)。

随着外泌体研究与产业化应用的日益火爆,外泌体需求与日俱增。除了依靠自己制备之外,市场上提供外泌体制备服务的公司也如雨后春笋般不断涌现。如何获取一款适合自己应用所需且纯度高的外泌体就成了一道难题。以下,就如何选择适合自己的可靠外泌体谈谈个人看法

外泌体研究与应用路线图

如何获取可靠的外泌体?

一、看外泌体来源

要根据个人研究或使用需求选择合适来源的外泌体。

外泌体的细胞来源非常之广泛,包括几乎所有种类的细胞都会分泌外泌体,但不同来源的外泌体具有不同功能。例如,间充质干细胞来源的外泌体也具备了很多间充质干细胞的功能,比如血管新生、组织修复、免疫调节功能等;神经干细胞来源的外泌体可能更能促进神经再生;而肿瘤细胞分泌的外泌体则在肿瘤的生长、转移和肿瘤微环境调节过程起着重要作用。我们可以根据自己的应用方向和需求选择合适的外泌体来源。

二、看外泌体纯化方式

外泌体的提取方法有多种:包括传统的差速离心、密度梯度离心,以及后来发展的超滤法、聚合物沉淀法、免疫分离、隔离筛选法、体积排阻色谱法等。这些方法各有利弊。

外泌体纯化的方式多种多样,目前存在的主流方式主要包括超速离心法、基于PEG-base沉淀法开发的试剂盒提取方式、磁珠免疫法、超滤离心法等等。这几种外泌体提取的方法各有优缺点。下图是试剂盒提取外泌体以及超速离心提取的外泌体几种指标的鉴定比较。

超速离心是从生物体液或细胞上清分离外泌体的金标准方法。采用低速离心、高速离心交替进行,可分离到大小相近的囊泡颗粒。目前在国外的重要期刊如Cell、Nature、Science以及其众多子刊中,超速离心是普遍应用的经典技术手段。

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实验结果表明超速离心获取的外泌体纯度更高,均一性更好,具有更小的粒径,但相对于PEG-base沉淀法,超速离心法的产量不高。二者都是实验室常用的外泌体提取方法,小编认为,我们可以根据各自的实验或应用的需求选择相应的方法,例如对于分子机制研究或载体的应用,建议使用超离法提取外泌体,获取更高纯度的外泌体,以减少杂质对应用结果的干扰。

如何获取可靠的外泌体?

四、外泌体三大质检验证,符合鉴定“金标准”   

外泌体经细胞分泌后存在于体液或者血液中,故外泌体的制备与提取一般为血液(全血、血浆)、体液(尿液、唾液、脑脊液、羊水、唾液等)、细胞上清液。

国际细胞外囊泡学会于2014年发布的一个指导性声明文件,文件指出了目前研究和定义细胞外囊泡及其功能所需要的最少实验要求。这个声明文件发表在《细胞外囊泡杂志》上。目前该声明正在筹划更新。

据国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年的提议,外泌体鉴定分为三个层面:透射电镜(transmission electron microscope,TEM)、Nanosight粒径、蛋白标志物。

NTA粒径分析

纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle TrackingAnalysis, NTA)是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析,结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度,检测10nm–1000nm 范围内的颗粒。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一;相较于其他表征方式,NTA技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态、检测速度更快。

外泌体电镜分析

双层囊膜结构(茶托状)是外泌体重要标志之一,但普通光学显微镜难以观察到此种亚显微结构。而透射电子显微镜 (Transmission electron microscope, TEM) 分辨率可达0.1 - 0.2 nm,可将被观察物体放大至数百万倍,是外泌体双层囊膜超微结构观测的经典方法。

外泌体标志物鉴定

通过对经典文献中普遍采用的抗体进行验证和挑选,优选了多种外泌体标志物抗体,如CD9、CD63、CD81、HSP70、TSG101、Alix等。

如何获取可靠的外泌体?

五、外泌体的保存及运送    

外泌体应低温保存;短时间(一般1周以内)可放4℃,长时间可放-20℃或者-80℃,并避免反复冻融。

展望:

2013年三位科学家因囊泡运输调控机制获得诺贝尔奖后,相关领域的研究迅速成为热点。特别是近几年外泌体相关基金和文章屡创新高,全球科研大咖纷纷扎堆此领域,有关外泌体载药、诊断、预后监测、免疫疗法等方向的文章陆续发表在 Cell、Nature 等各大顶级期刊上。外泌体已成为生命科学/临床医学研究的一大热点。目前该领域累计已经发表了8,000余篇Medline论文,而我国的外泌体领域研究更是如火如荼,国自然资助项目数量均呈现井喷式增长,2019年外泌体国自然项目资助数达581项,总金额达2.45亿。外泌体的研究领域十分广泛,除了癌症领域,在神经系统疾病、心血管等领域也均有研究进展。在此背景下,外泌体研究必然是医生科学家切入的最好时机。

参考文献:

1. Exosomes Derived from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells as Treatment for Severe COVID-19. Stem Cells Dev. 2020 Jun 15;29(12):747-754.

2. Embryonic stem cell-derived exosomes promote endogenous repair mechanisms and enhance cardiac function following myocardial infarction. Circ Res. 2015 Jun 19;117(1):52-64.

3. Exosomes in mesenchymal stem cells, a new therapeutic strategy for cardiovascular diseases? Int J Biol Sci. 2015 Jan 12;11(2):238-45.

4. Circulating microRNAs are promising novel biomarkers of acute myocardial infarction. Intern Med. 2011;50(17):1789-95.

5. Extracellular Vesicles from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Downregulate Senescence Features in Osteoarthritic Osteoblasts. Oxid Med Cell Longev. 2017;2017:7197598.

 

发布者:木木夕,转转请注明出处:https://www.cells88.com/wmt/5936.html

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