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眼下火热“外泌体”的问与答

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm),现今,其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体,且外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。
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1.什么是外泌体
外泌体与细胞外囊泡是什么关系
 
外泌体属于细胞外囊泡的一种。国际细胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)对细胞外囊泡(extracellular vesiclesEVs)的定义是:细胞分泌到细胞外的脂膜包裹的囊泡。根据其生成过程、释放途径、大小、内容物及其功能等方面的不同而分为三种类型,分别为微囊泡(Microvesicles)、外泌体(Exosomes)和凋亡小体(Apoptosis bodies)。
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微囊泡是细胞直接向外出芽(outward budding)或“挤出”细胞而形成的细胞外囊泡,含细胞膜和部分胞浆成分。MVs的粒径范围为100nm~1000nm,表面含CD40、整合素、选择素等蛋白,磷脂酰丝氨酸的含量较高。

凋亡小体是细胞在凋亡或死亡过程中“脱落”或“破裂”释放到细胞外形成的囊泡,可以理解为“从细胞逐渐脱落的膜结构”。其形态异质性程度最大,大小50nm~ 5000nm,但总体来说粒径大的占比较高。其膜上通常含有较多的磷脂酰丝氨酸。

外泌体起源自细胞膜向内出芽(inward budding)形成胞内小体(endosome),在细胞内经过早期胞内小体、多囊复合体、定向组装、迁移等过程,与细胞膜融合后以外吐(exocytosis)方式排出细胞。因而成分和结构更为复杂,甚至包含部分从胞外间质或培养液中“吞入”的成分。外泌体大小约50-150nm,含有细胞膜常规的四跨膜蛋白(CD9CD63CD81等);热休克蛋白(Hsc70)、溶酶体蛋白(Lamp2b)、肿瘤敏感基因101Tsg101)融合蛋白(CD9flotillinannexin)等蛋白,膜上胆固醇和二酰甘油含量较高。
三种细胞外囊泡均来自于细胞(为方便描述通常将生成胞外囊泡的细胞称为其“母细胞”)。同一种细胞在不同时间和生长状态下可生成外泌体、微囊泡和凋亡小体。三种胞外囊泡都不可避免地带有母细胞的成分,如膜蛋白、骨架蛋白、细胞质蛋白、磷脂类、代谢产物等。无论其分子组成还是粒径大小都存在着或多或少的重叠。

尽管从理论上三种胞外囊泡存在明显不同,但目前尚无一种技术可将外泌体与微囊泡或凋亡小体分离开来,也没有明确的分子标记用于鉴别三种胞外囊泡。人们往往将它们通称为“细胞外囊泡”。

三种细胞外囊泡中,外泌体的平均粒径最小、均匀度最高【粒径分布范围最窄】、组成最为复杂、功能最为多样。因而,理论和应用价值最高,得到了最深入的研究和广泛应用。所以,人们提到细胞外囊泡大多是指外泌体,在学术论文和日常交流中往往将外泌体(ExosomeExo)与细胞外囊泡(extracellular vesiclesEVs)混用。

2.外泌体从哪来?

外泌体的起源、合成和分泌经历以下过程:母细胞的细胞膜通过内吞或“向内出芽(inward budding)”形成早期胞内小体(early endosome),在细胞内部逐渐成熟为晚期胞内小体(late endosomes)和多囊小体(multivesicular bodiesMVBs)。在外泌体的雏形以腔内囊泡(intraluminal vesiclesILVs))的形式存在于MVBs内部。随后MVBs与细胞膜融合,以外吐(exocytosis)的方式将ILVs排出细胞外成为外泌体。

早期胞内小体和晚期胞内小体成熟为多囊小体的过程也是外泌体的“组装过程”:多种胞质内物质包括蛋白(酶分子、热休克蛋白等)、核酸(主要是RNAmRNAmiRNApiRNAsnoRNAsnRNArRNAtRNAY-RNAscRNA等)、代谢产物等主动或被动载入胞内小体膜上或者囊腔内。
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3.外泌体到哪里去了
相比外泌体生成的相对明确的“线性流程”,外泌体被细胞释放后的去向则明显复杂多变和充满不确定性。若临近组织细胞可识别和“捕获”外泌体,则外泌体被临近细胞摄取利用。若临近细胞不能识别和捕获外泌体,则外泌体将通过循环系统被运输至较远的细胞或组织处。
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无论临近还是远处的组织细胞摄取和利用外泌体,主要通过以下几种不同的作用机制:

①外泌体膜表面配体与接收细胞膜上的受体结合,激活受体介导的信号转导途径,被激活的接受细胞通过内吞作用,将内容物摄入细胞内。

②接收细胞直接以内吞方式将外泌体摄入细胞,外泌体内容物释放到细胞内,部分外泌体成分参加新的多泡体生物合成过程。

③外泌体膜与细胞膜直接融合,将外泌体内容物释放入细胞质中。

外泌体的去向有很大的不确定性并受多种因素的影响。既存在明确目的地的定向迁徙,如受体介导的特异性结合、干细胞或肿瘤细胞的“归巢”;也存在无目的或随机性的游走。既可能被循环系统和网状内皮系统非特异吞噬掉,也可能受接收细胞局部微环境和细胞状态的影响而改变去向。
4.外泌体长什么样子
相比抽象概念“30~150nm磷脂囊泡”,具体的形象无疑会给人更加清晰和深刻的印象。外泌体大小30~150nm,这虽是具体尺寸,但仍令人难以想象。以头发为参照就容易想象它了,头发丝直径约20-120μM,外泌体大体上是头发丝的千分之一。

关于外泌体的形状,最常见的描述是“杯口状”或“盘状”。果真如此吗?
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因为外泌体太小,一般显微镜根本无法观察其形态,只能采用电子显微镜观察,最早采用透射电子显微镜(TEM)观察并报道的外泌体图像就是这种杯口状。之后便被广泛接受和传播,一提起外泌体的形态就会以杯口状来描述。由于电子显微镜观察前的样本处理过程,可能导致外泌体脱水皱缩,这种已被普遍接受的外泌体形态可能是处理后造成的,而并非其自然形状。
 
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之后,人们采用扫描电子显微镜(SEM)和冷冻电子显微镜(CEM)等,陆续观察记录到形态各异的外泌体图像。更多提示外泌体是不同大小的球形,有双层的外壳。不仅仅揭示了更清晰的外泌体形态,也提示了外泌体的结构。
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这些体外观察到的外泌体是否能真实反应在体内的自然状态?我们认为这些观察只是提供了外泌体形态的一个基本线索,而远非体内的自然状态。

请记住千万不可将外泌体想象为一个“坚硬不变的固态球体”,这不符合外泌体在体内生成、运输和利用的生物过程。也难以解释外泌体活跃的生理和病理功能。

我们提出外泌体在体内自然形态的推测和想象:体内外泌体以球形为基础,但大小和形态各异;外泌体形态和结构并非一成不变,随着环境和自身状态而动态变化;外泌体是柔软的、具有弹性和可变性。可能像红细胞一样可以“挤过狭窄的毛细血管和组织间隙”
【变形也可能是外泌体通过生物屏障的方式之一】
5.外泌体的结构与组成
外泌体的结构是一个囊泡结构,外泌体膜【外壳】由双层磷脂和蛋白构成,内部是所谓的囊腔。外泌体膜为疏水性结构,而腔内为亲水性环境。【您可以将它想象成一个撒尿牛肉丸,油(磷脂)和肉(蛋白)糅合成丸子外壳,而丸子内汤汁便相当于外泌体内容物。】
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正如要做出Q弹和软硬适口的牛肉丸子,需要掌握好油和肉的种类和搭配。外泌体与牛肉丸一样有硬度和弹性,外泌体硬度和弹性主要由膜上的磷脂种类和比例决定。
外泌体膜为磷脂双层膜,与母细胞膜的磷脂相似,但磷脂的含量和比例略有不同。外泌体膜常见的磷脂包括:鞘糖脂、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇和磷脂酰乙醇胺等。其中胆固醇、磷脂酰丝氨酸和神经鞘磷脂含量较高。

外泌体膜磷脂对外泌体的性质如带电性、硬度和流动性都有重要影响。例如上述外泌体膜上常见磷脂中,鞘糖脂和磷脂酰丝氨酸为阴性离子;鞘磷脂、磷脂酰胆碱和胆固醇为中性;而磷脂酰乙醇胺为弱阳性。不同细胞来源外泌体由于磷脂比例不同,其外泌体的电荷也不同。外泌体带电性是外泌体的一个重要理化属性,也是进行分离纯化所依据的基础特性之一。

外泌体膜为半固态,具有流动性和通透性的生物膜。“镶嵌”在膜上的蛋白不仅可能发生位置移动,也可能发生构型的改变;同时外泌体内外物质也可以主动或被动通过外泌体膜进行流动和交换。外泌体膜的流动性和通透性也是进行药物加载操作的重要结构基础。

外泌体膜蛋白

从外泌体的生物合成过程,不难判断外泌体膜蛋白与母细胞膜具有相似性。外泌体膜上蛋白大部分来源于母体细胞膜,当然也包含在后期胞内小体和多囊小体阶段掺入的某些细胞质蛋白。这样,外泌体膜蛋白中既有来自母细胞膜,也有来自胞浆的蛋白。
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来源于母细胞膜的蛋白如CD63CD81CD82CD9等、细胞浆膜蛋白如浮舰蛋白;在MVB加工过程加入的蛋白如AlixTsg101等;细胞质蛋白如细胞骨架蛋白(微管蛋白、肌动蛋白、肌动蛋白结合蛋白)、内膜融合/转运蛋白(膜联蛋白、Rab蛋白),和信号转导蛋白(蛋白激酶、G蛋白);以及多种代谢酶类(过氧化物酶、丙酮酸和脂肪激酶、烯醇酶)等。

膜蛋白对外泌体的去向和功能都至关重要。接收细胞识别外泌体膜表面的受体或配体蛋白而选择性结合,从而影响外泌体的“靶向性”;通过配体-受体的信号转导途径,外泌体也可能直接诱导接收细胞的生物反应,从而调控其生物行为,例如细胞分化、增殖或者凋亡等。

外泌体内部是疏水性囊腔,囊腔内物质通称为“外泌体的内容物”【像牛肉丸里面的灌汤】,含有来自母细胞微环境和细胞质的多种蛋白、核酸、脂类和代谢物等。国际胞外囊泡数据库ExoCarta中收录的内容物包括:9769种蛋白质、3408mRNA2838miRNA1116种脂类等。

外泌体合成过程主要在细胞质内,RNAs在加工过程中进入外泌体内,且受到磷脂双层膜保护而维持稳定,因此外泌体中含有丰富的RNAs包括mRNAmiRNApiRNAsnoRNAsnRNArRNAtRNAY-RNAscRNA等。外泌体RNAs不仅仅是液体活检最有价值的信息分子,也是外泌体发挥细胞调控功能的重要效应分子。

外泌体中DNA含量极少,不含或极少含有核蛋白、线粒体、内质网和高尔基体来源的蛋白【这也与外泌体的生物合成过程相关】。

无论外泌体膜还是内容物既与母细胞有很高的相似性,也存在着差异。母细胞浆膜上高含量的蛋白,在外泌体膜上可能含量较少甚至缺失,表明外泌体并非简单浆膜融合或浆膜的一部分。外泌体内容物的种类和含量也受母细胞的生理状态和微环境的共同影响,呈现时空的多样性和异质性,这是EVs研究和应用中的难题之一。

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