干细胞外泌体源头供货

临床级间充质干细胞的技术壁垒:工艺制造

临床级间充质干细胞的技术壁垒:工艺制造

间充质干细胞的扫描电镜图    Steve Gschmeissner/SPL

“你之所以活着,是因为你不断地更新各种组织和器官,或让它们恢复活力。在体内,皮肤、肠道和血液等细胞逐渐成熟,在一段时间内发挥功能,然后过期,被不断更新的细胞取代,从而更新组织。在每一个发生这种年轻化过程的组织中,都存在一个产生这些分化细胞的来源。这个来源被称为 ‘干细胞’。”

美国生物学家 Arnold Caplan 在他的主页上这样写道

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书接上回,在上一期临床级间充质干细胞的技术壁垒:国际纵览>里,我们简述了以AlofiselTemcellStempeucel为代表的商业化间充质干细胞疗法,同时也概述了我国干细胞临床研究和转化现状,最后指出了间充质干细胞药物开发面临的技术壁垒。
 
如果要开发一种“现货型”同种异基因间充质干细胞产品,异质性必然是是一道迈不过去的坎。如何去面对这个挑战,如何将间充质干细胞产品异质性的影响降到最低。
 

-01-

间充质干细胞的基本概念

2006年,国际细胞治疗协会(ISCT给出了间充质干细胞定义的最基本定义,也就是间充质干细胞最低的鉴定标准从细胞形态,表面标记和分化能力三个方面定义了人类间充质干细胞(hMSCs)的最基本标准。
  • MSCs在标准培养条件下,呈贴壁生长;

  • MSCs表达CD105、CD73和CD90,不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面标记;

  • MSCs在体外诱导可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞

然而,人类间充质干细胞最基本标准这只是反映了“干性”,而不是决定其治疗属性的免疫调节和血管再生作用。况且,不同来源的MSCs表面分子特征差异巨大研究结果提示,不同组织来源的MSCs具有差异性(比如细胞大小、增殖潜能、分泌细胞因子种类和数量,免疫抑制能力也不尽相同)。
2019年,ISCT继续完善了MSCs的基本标准,增加了两点:第一,MSCs的组织来源。第二,与治疗疾病相关的MSCs功能测定

-02-

间充质干细胞产品的异质性

间充质干细胞疗法在某些疾病上取得了巨大成功,这的确让业内专家兴奋不已。纵观先前的大量临床试验间充质干细胞疗法还存在一定的临床局限性。临床失败的关键在于,其免疫调节血管再生作用在临床试验中具有不可预测性。究其本质,根源在于MSCs是一种活的药物,其关键质量属性(CQAs)很难界定。

间充质干细胞产品的CQAs

MSCs产品的常规检测,除了鉴定、活性、纯度、效力、增殖能力、基因组稳定性和微生物实验等评估外,还应检测与MSCs治疗功能相关的关键质量属性(比如抑制T细胞增殖或IDO表达)

临床级间充质干细胞的技术壁垒:工艺制造

图1. 间充质干细胞的质控体系总览(步步先生绘制)

如何评价细胞产品的CQAs,这是细胞治疗领域面临的独特的一个挑战。传统的化学药品,其结构和效力是可以严格定义。而MSCs产品则不同,这是一种动态“活的药物”。

 

临床试验开始前,MSCs标准化产品的治疗效力是至关重要的。效力(Potency),FDA给出的定义是 “在适当实验室方法检测下或在预期方式管理条件下,通过大量临床数据获得产品的特殊能力或功能。” 通常,效力用来评价药物产生特定生理功能的浓度或数量,由强度(strength)和效果(effectiveness)两个因素组成,即相同强度(一般指浓度)下所取得的效果。

 

正是因为如此,开发一种针对MSCs产品效力的测定方法非常有必要,准确地将MSCs产品的CQA与它们的治疗功能相关联。目前,用于间充质干细胞产品效力最广泛的评价方法是:淋巴细胞增殖抑制试验与免疫调节功能的替代标志物(即IDO表达或TSG-6表达)相比,显然不如后者被认为更能代表效力,因为它可以直接读出生物活性。

间充质干细胞产品的异质性

MSCs一种异质性细胞群,其基因和蛋白表达谱图与很多因素有关诸如供体特征,组织来源,分离方法,以及体外扩增培养方式。不同供体、不同组织来源,甚至不同的制备工艺都可能会造成MSCs终产品出现异质性。

 
下面是MSCs异质性造成不同治疗效果:
  • 针对GVHD适应症,Mesoblast 公司开展的3期临床试验(NCT00366145)中,Remestemcel-L是来自1个供体扩增至3-4代的MSCs,以满足240名受试者的使用需求。临床试验结果比较积极,但未能达到主要临床终点。
  • 同样是针对GVHD适应,法兰克福大学医院开展的2期临床试验中,使用了来自8个供体混合的1-2代 MSCs,治疗26名患者,取得了77%的总缓解率。
为什么会出现不同的临床结果?这是MSCs产品的异质性(供体不同,细胞代次不同,工艺不同)的原因,还是患者疾病个体化差异造成的的原因?需要肯定的是:如果干细胞采用自动化制备,既可减少制备过程中的人为操作因素,也能降低产品异质性风险。
 
目前,在制备过程中尽量避免MSCs产品异质性的策略有两种:

  生物材料 

第一种是使用生物材料。在聚乙二醇水凝胶基质上,MSCs扩增过程可避免细胞表面标志物和细胞因子表达的降低。3D培养系统也有利于MSCs在扩增过程中维持早期传代的表型。

  诱导多能干细胞

第二种是使用多能干细胞。由于iPSC增殖能力更强,因此可以轻松扩增大量iPSC,然后再分化获得大量的MSCs。因此,iPSC-MSCs可能是规模化生产MSCs的有效解决方案。

  低温保存和复壮培养

MSCs产品异质性的另一大挑战,是冷冻保存对MSCs效力存在潜在的不利影响。研究发现,可以通“培养复壮”MSCs的方式来解决。
 
例如,Alofisel治疗肛周瘘管3期临床试验的成功,可能就归功于对解冻后的MSCs采用了“培养复苏”的策略,即在使用解冻的MSCs前进行短暂复苏培养,从解冻到输注需要至少24小时。这个研究成功表明,冷冻对细胞的不利影响是可逆的。
 
 

-03-

如何增强间充质干细胞的治疗效果

如果建立MSCs产品效力的标准化质控方案,则有助于降低临床失败的风险。虽然不能完全避免临床失败,毕竟MSCs本身也不可治疗所有疾病,它不是包治百病的“万能神药”。临床试验表明,在保证安全性的前提下,MSCs的大剂量输注可保证某些临床应用的有效性

 

为了最大限度地发挥临床效力,促进MSCs的“天然属性”,且独立于冷冻保存,扩增倍数,供体和组织来源等,我们可通过生物工程解决方案,可增强MSCs的“天然属性”。

临床级间充质干细胞的技术壁垒:工艺制造

图2. 如何增强间充质干细胞的“天然属性”

A)小分子“预处理”,可促进MSCs免疫调节和再生因子分泌。优点是简单有效,缺点是作用短,仅持续数小时至数天。

B)颗粒化处理,可维持MSCs免疫抑制很长时间,优点是不挑细胞,缺点是成本贵。

C)基因修饰出来,可通过基因修饰MSCs过表达某些因子,要么增强其固有功能,要么过表达其他治疗方法,要么改造成可用于癌症治疗的细胞。

D)溶瘤病毒处理,MSCs可屏蔽溶瘤病毒以躲避自身免疫细胞攻击,并在肿瘤组织中释放病毒以杀死肿瘤细胞。

小分子预处理

小分子“预处理”,是一种增强MSCs治疗效果的简单策略。其中最著名的就是Brainstorm公司的MSCs产品NurOwn®其专利培养基(含GDNF、HGF和VEGF等)可诱导细胞分泌高水平神经营养因子(NTF),将MSCs转化为MSC-NTF细胞,后者可以直接递送至损伤部位,分泌多种神经营养因子和免疫调控因子,触发生物学效应,最终减缓或稳定疾病进展。
在II期临床试验(NCT02017912)中,渐冻人症患者在接受NurOwn®治疗24个月后,病情进展与对照组相比减缓。Brainstorm正在扩大NurOwn®的适应症范围,招募患者参加硬皮病(NCT03799718)的II期临床试验。

载药颗粒处理

小分子“预处理”虽然有用,但效果仅持续数小时到几天。因此,一种小分子封装微粒(MPs)也被用于提高MSCs产品的效力。MP含有生物相容性材料,可以根据其成分、分子量、载药量和药物释放速度,来调控MSCs产品的治疗作用。说白了,就是一种缓释剂。

 

与经游离的布地奈德(一种肾上腺皮质激素类药)“预处理”MSCs相比,载有布地奈德的MP处理MSCs后,在体外显示出四倍的IDO活性增强。实验结果是:经IFN-γ刺激后,间充质干细胞产品对外周血单个核细胞(PBMC)的抑制作用提高了两倍

基因改造

除了增强其“天然属性”,另一种策略是对MSCs进行基因改造,将其改造成生物制剂“生产车间”。为了在MSCs内产生所需的生物制剂,转导和转染是最常见的方法。
 
Suresh等人的一项研究表明,经过基因工程改造的MSCs,通过表达一种具有抗氧化作用的蛋白,在大鼠模型中改善了心肌梗死后的心脏功能。此外,还可以将MSCs改造成携带抗肿瘤药物的载体。MSCs可以避免免疫细胞追杀,利用肿瘤趋化性到达肿瘤部位,达到癌症治疗的目的。

溶瘤病毒处理

溶瘤病毒(OVs)处理也是一个策略,可直接裂解肿瘤细胞,或触发抗肿瘤免疫反应,通过MSCs作为其载体,定位到肿瘤部位,释放溶瘤病毒发挥作用。如果在MSCs中装载OVs,则可有效保护OVs免受机体破坏而影响其有效性,有点类似于“特洛伊木马”使用MSCs作为OVs载体的一个限制是:MSCs在转导时仅表现出中等感染力

 

基于溶瘤病毒技术联合MSCs疗法临床试验(NCT02068794),用于治疗复发性卵巢癌。临床前数据显示,用OV-MSCs治疗SKOV3卵巢癌小鼠后,小鼠寿命明显长于仅用OVs治疗的小鼠。

 

-04-

文末小结

本期内容,我们简单介绍了MSCs的最基本标准,新增两条标准:细胞的组织来源效力评价。在开始临床试验之前,MSCs产品效力的标准化是至关重要的。
 
然而,不同供体、不同组织来源,甚至不同的工艺制造都可能造成MSCs的异质性,这给临床结果稳定性制造了不小的挑战。我们可通过生物工程解决方案(小分子预处理,载药颗粒处理、基因改造和溶瘤病毒处理),可增强MSCs的治疗效果。
 
如果建立MSCs产品效力的标准化质控方案,则会降低其异质性的影响,有助于降低临床治疗失败的风险。当然,不同给药途径和患者适应症的选择也是影响MSCs临床成功的关键因素。

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