间充质干细胞、免疫细胞、外泌体源头供货

iPSC细胞疗法在日本的临床研究

iPSC细胞疗法在日本的临床研究

撰文:步步先生

来源:干细胞者说

 

 

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细胞疗法是指利用干细胞或干细胞衍生的细胞,以特殊技术移植到体内,取代或修复病人受损的细胞、组织或器官2007年,首次报道人工诱导多能干细胞iPSC获得成功,迄今为止已有15年了。
 
iPSC从基础科研逐渐走向临床研究。iPSC被探索用于各种退行性疾病和损伤的细胞治疗,如帕金森,脊髓损伤、视网膜黄斑变性等。人们对基于iPSC的细胞治疗寄予了无限期待,也取得了显著的进展。作为,iPSC技术的起源地之一,日本研究机构有着不同的研究分工。
 
温故而知新本文就其临床研究进行了综述,包括眼科、神经学、心脏、血液学、软骨和代谢性疾病。以期让大家更加了解iPSC疗法的在日本的发展。

iPSC细胞疗法在日本的临床研究

日本开展的iPSC临床研究项目

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年龄相关性黄斑变性:RPE细胞

在我们的眼睛中,存在着一种视网膜色素上皮细胞,而在年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration,AMD)中,视网膜色素上皮细胞将逐渐丧失功能,并导致黄斑中的光感受器死亡,影响视力甚至最终形成失明。如果早期发现疾病,可以通过抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)药物治疗。
 
日本理化所Masayo Takahashi(也就是高桥政黛)研究组正在研究移植湿性AMD患者iPSC分化的视网膜色素上皮(iPS-RPE)细胞薄片的可行性。采集两例AMD晚期患者的皮肤成纤维细胞,制备成iPS-RPE细胞。在这两例患者中,其中1例患者接受了自体iPS-RPE细胞薄片移植手术。术后1年,移植的RPE细胞薄片证实移植成功,视力得到维持
 
随后的临床研究,同样是这个研究团队,将从 HLA-homo iPS 细胞库中制备的RPE细胞移植到与HLA匹配的湿性AMD患者中。局部使用类固醇,没有使用免疫抑制剂。在全部5例接受移植的病例中,经过1年的观察期,证实了移植细胞的存活,并且没有异常生长。在临床试验中,观察到的不良事件包括轻度炎症、疑似轻度排斥反应、视网膜水肿、角膜上皮脱离和无菌性眼内炎。中期结果表明经过1年的随访,HLA匹配的异体iPS-RPE细胞移植是安全的,并且稳定存
 

 

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角膜缘干细胞缺乏症:角膜片

角膜之所以维持透明,它表面的上皮细胞功不可没。我们人类的角膜上皮细胞不断生长,不断更新,而维持这种更新的源泉就是角膜缘干细胞。当角膜缘干细胞缺乏时(即角膜缘干细胞缺乏症,limbal stem cell deficiency,LSCD),会导致角膜上皮持续性缺损,角膜血管化、角膜溃疡感染、不透明,严重者造成角膜穿孔、甚至危及整个眼球,导致失明。供体角膜移植已被用于治疗可能导致失明的严重角膜上皮疾病,但也存在排斥反应和供体短缺的问题。

 

日本大阪大学的眼科医师 Koji Nishida(西田幸二)团队利用iPSC来源的角膜细胞组织层来修复损伤的角膜。研究小组开发了一种二维培养系统“SEAM方法”,通过促进iPS细胞自分化来组织重建所有的眼样结构。这个细胞薄片构成眼睛的主要细胞群(包含角膜上皮、视网膜和晶状体上皮)出现在组织的特定区域。研究小组从二维组织结构中分离出了角膜上皮祖细胞,并成功地产生了功能性的角膜上皮组织。

iPSC细胞疗法在日本的临床研究 iPSC治疗角膜缘缺乏症示意图 

研究小组通过将人类iPSC制备的角膜上皮组织移植到动物模型中,证明了治疗效果。在2019年7月至2020年12月,这个研究小组把用iPSC制作的厚度0.05毫米薄膜状角膜组织,移植给几乎丧失视力的“角膜缘干细胞缺乏症”的4名患者的全球首例临床研究已完成。

 

此后经过1年的随访观察,未发生排异反应和癌变等问题,确认了安全性。全部患者症状均有改善,其中3人的矫正视力提高,有患者从0.15升至0.7

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帕金森病:多巴胺神经祖细胞

大多数哺乳动物,大脑在胚胎时期就已经完成大部分,只有一小部分神经在出生后持续发展。神经损伤引起的疾病将导致永久性的残疾,如何利用iPSC来修复神经系统是目前干细胞疗法的热门研究

 

人们发现利用iPSC分化的多巴胺能神经元可以治疗帕金森病。帕金森病是大脑黑质区(subatantia nigra)分泌多巴胺的神经细胞退化造成的一种疾病。帕金森病仅次于阿尔茨海默病,是第二常见的神经退行性疾病。在美国,男性的终生风险为2%,女性为1.3%。

iPSC细胞疗法在日本的临床研究
 iPSC治疗帕金森示意图 

日本京都大学iPS细胞研究所JunTakahashi(高桥淳,也就是高桥政黛的丈夫)研究小组于2018年8月开展使用iPSC来源的多巴胺神经祖细胞治疗帕金森病的临床试验临床试验移植的细胞来自HLA-homo iPS 细胞库。种子细胞iPSC经过诱导分化,并通过流式细胞仪分选纯化出corin阳性的细胞(corin是多巴胺神经祖细胞的细胞表面标记物)研究小组将与HLA匹配的异体iPSC诱导分化为多巴胺神经祖细胞,配合低量免疫抑制剂,通过定位脑手术将大约500万个分化的细胞移植到患者大脑纹状体左右两侧皮质部分

 

在临床试验之前,先证实了移植的人类iPSC来源的多巴胺神经祖细胞在帕金森病的食蟹猴模型中的有效性和安全性。经过两年的跟踪,没有观察到猴子肿瘤的形成,也没有发现任何恶性转化的证据,确认了安全性。结果显示:移植的猴子运动活动增加,帕金森病症状有所改善。PET分析显示,移植的细胞在大脑中合成了多巴胺

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脊髓损伤:神经祖细胞

脊髓损伤(Spinal cord injury),通常指脊髓受到外部影响,造成损伤部位及其以下部分瘫痪或全部瘫痪,使患者终身残疾。脊髓损伤是一种比较常见的外伤。脊髓损伤治疗的难点在于神经传导重建及运动功能的恢复

 

日本庆应大学生理学 Hideyuki Okano(岡野荣之)研究小组于2019年2月被批准开展使用采用iPSC来源神经祖细胞治疗亚急性期脊髓损伤的临床研究。但由于COVID-19疫情原因,研究被延后至2021年年底才得以开展。临床试验移植的细胞来自HLA-homo iPS细胞库。临床试验选择的适应症,为亚急性脊髓损伤(C3/4-Th10水平,损伤后14-28天内),共纳入4名受试患者。试验的主要目的是评估hiPSC-NS/PC移植细胞和移植方法的安全性次要目标是获得其对神经功能和生活质量影响的初步证据

iPSC细胞疗法在日本的临床研究

iPSC治疗脊髓损伤的临床概要

细胞来源:试验使用的细胞来源是iPSC-神经祖细胞。

细胞处理:
在预定的移植手术前4天,细胞将进行解冻复苏,经过培养和洗涤处理后,200万个细胞重悬在20μL的人工脑脊液中,保持在4°C环境,直到移植。
移植方式:
移植中患者接受全麻,通过术前MRI和术中超声辅助,细胞在手术显微镜下通过神经注射器移植到损伤部位的中心。

 

 

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心力衰竭:心肌薄片

心力衰竭(heart failure)简称心衰,是由于心脏泵血力量不足导致的一种心脏疾病。缺血性心脏病是由于冠状动脉阻塞引起心肌组织慢性缺血,从而导致功能性心肌细胞坏死。然而,成熟的心肌细胞是不能自我更新的,缺血和坏死区域的心肌逐渐被纤维组织所取代。因此,补充功能性心肌细胞是延缓心衰进程的一种合理方法。因为心肌细胞没有增殖能力,难以大量产生。因此,骨骼肌细胞、骨髓单个核细胞和间充质干细胞(MSCs)都是候选细胞,用于替代心肌细胞,并进行了动物实验和临床试验。

起初,细胞片由自体骨骼肌细胞制造的,可以直接贴到心脏表面。治疗机制主要依靠细胞片旁分泌的营养因子和细胞片细胞与宿主心肌融合。然而,因为是自体个性化移植,缺点很明显:一是患者需要等待时间长,二是制作成本较高。因此,开发一种通用型标准化现货性产品,尤为重要。细胞薄片,便是这样一种产品,通过HLA配型后的iPSC衍生的心肌细胞薄片,可当做通用型产品

 

在动物实验中,研究发现人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞在组织学上和电生理学上都能与宿主心肌匹配结合,这与以前移植的非心肌细胞不同。在猴子实验,也显示了其生存能力和功能的改善。在猴子心肌梗死模型中,HLA匹配的猴子iPSC来源的心肌细胞即使在移植后12周仍能存活,并产生宿主心脏的功能改善。然而,在所有的猴子中都观察到一些室性心律失常,这表明处理移植前的心律失常的影响是必要的

iPSC细胞疗法在日本的临床研究

在日本,HEARTSHEET® 的发明者之一,大阪大学的外科医生 Yoshiki Sawa教授通过 iPSC制成心肌细胞薄片,用于治疗猪的心力衰竭。研究小组研究了心脏功能改善的机制,包括分析了iPSC来源的心肌细胞的旁分泌因子。研究小组通过HLA-homo iPS 细胞成功制备了大量高度安全的心肌细胞薄片,可以用于人体移植。目前,研究小组正在进行一项临床试验,以验证心肌细胞薄片治疗心力衰竭的安全性和有效性(jRCT2053190081)。临床适应症是缺血性心脏病,招募10个病人。

 

 

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血小板减少症:血小板

在日本,每年临床需要超过170万升血小板,主要献血者捐赠。尴尬的是,血小板在采血后只能保存4天。由于新生儿出生率下降和人口老龄化,献血者群体的数量正在减少,但需要血小板的老年人群体数量正在增加。未来,不仅是血小板制剂,而且输血制剂也可能出现供应不足的情况。

 

通常,再生障碍性贫血即“再障”或其他疾病造成的严重血小板减少,需要进行血小板输血。然而,输血可能会引起血小板输血顽固可能发生,即输血后血液中的血小板不会升高。其主要原因是外来的血小板被患者自身免疫细胞破坏。在这种情况下,血小板不能通过异基因血小板输血来补充。如果血小板是由自体细胞制造的,输血就不会发生免疫反应。

 

日本京都大学iPS细胞研究所(CiRA)教授 Koji  Eto,利用生物反应器从iPSC中制造出大量血小板,并开展再生障碍性贫血合并血小板输血顽固性的临床研究。临床试验目的是检测血小板制剂的安全性。单剂量递增研究,输血后随访一年。血小板治疗的过程:采集患者细胞,制备成iPS细胞。接着,再把iPS细胞制备成造血祖细胞,再分化成巨核细胞,并冷冻作为主细胞库,巨核细胞可以长时间储存。最后,由巨核细胞制备血小板。需要注意的是,血小板分离、浓缩和清洗后,需要通过照射根除残留的巨核细胞

iPSC细胞疗法在日本的临床研究

血小板批量制造方法概要

 

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癌症免疫疗法:免疫细胞

近年来,癌症免疫治疗作为手术治疗、化疗(抗癌药物和激素给药)和放疗后的重要治疗选择,越来越到关注。

 

NKT细胞(自然杀伤T细胞)是一类兼具NK细胞和T细胞部分表型和功能的细胞亚群,通过识别CD1d上的MHC-I激活被激活的NKT细胞,通过产生穿孔素等表现出直接的细胞毒活性。同时,也产生大量的细胞因子(如IFN-γ),诱导激活NK细胞和CD8+ T细胞,发挥抗肿瘤作用。

iPSC细胞疗法在日本的临床研究

基于iPSC的癌症免疫细胞疗法

作为一种治疗头颈癌的新疗法,Haruhiko Koseki 和 Shin-Ichiro Fujii 研究组正在进行一项使用iPSC衍生的NKT细胞的临床试验(jRCT2033200116)。iPSC衍生的NKT细胞治疗的过程:首先,将异体iPSC诱导成NKT细胞,进行扩增培养,然后将约 3X10*8 个制备的NKT细胞,注入已接受现有患者的肿瘤部位血管内。根据输入后不良反应等情况及时调整剂量,共计回输3次。随访2年,确认安全性和有效性

 

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关节软骨损伤:软骨组织

骨关节炎是世界上最常见的关节疾病,60岁以上人群中,10%的男性和18%的女性都受其影响。

日本京都大学iPS细胞研究所(CiRA)Noriyuki Tsumaki教授开展使用iPSC来源的软骨移植治疗关节软骨损伤的临床试验(jRCTa050190104)研究团队已成功制备出了iPSC来源的高质量软骨。先前动物研究证实,iPSC来源的软骨不会产生肿瘤,并在移植区可以再生软骨。

 

临床研究目的是评价软骨损伤患者实施细胞移植后的安全性。主要终点事件是不良事件发生的频率和是否肿瘤发生。为了制备软骨,软骨细胞从来自HLA-homo iPS 细胞库里的iPSC诱导,软骨组织由软骨细胞产生。研究人员的目标是在未来用这种疗法来治疗膝关节骨性关节炎。

 

在临床研究中,研究者对患者实施单侧膝关节腔细胞移植,参与临床试验的患者4例,年龄在20-70岁,软骨部分损伤。关节镜下实施细胞移植修复软骨缺损。患者术后恢复6周。随访1年,观察软骨再生和修复情况

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尿素循环障碍:肝细胞

尿素循环障碍是指当尿素循环中某一种酶有先天性缺陷时,氨合成尿素发生障碍,游离的氨蓄积体内,形成高氨血症,临床上表现为严重的脑功能障碍。这个过程发生在肝脏细胞中。

 

传统的治疗手段需要进行肝脏移植,但出于安全考虑,日本规定只有在患儿体重达到6kg(一般出生3~5月以上)后才能进行移植。为了给后续的肝移植打下基础,需要在肝移植之前需要进行“桥梁治疗”。在日本,由于没有来自捐赠肝移植供体的肝细胞,最大挑战是确保质量一致的肝细胞作为肝细胞移植的稳定供应来源。

 

日本国立成育医疗研究中心 Akihiro  Umezawa 研究小组专注于制备人胚胎干细胞来源的肝细胞(JMA-IIA00412),建立了人类胚胎干细胞来源的肝细胞库,长期低温保存,能够适应紧急使用。

 

临床研究中,在一名患有“尿氨酸血症1型”的尿素循环异常症的患儿出生的第六天,研究小组分两次在腹部注射1.9X10*8个胚胎干细胞诱导分化来的肝细胞,用以提高肝脏的解毒功能。给药完成后,没有任何与移植过程相关的并发症或不良事件。患儿进行胚胎干细胞治疗后,大概6个月左右就接受了来自父亲的活体肝移植。同时,医院给患儿使用免疫抑制剂,避免了患儿产生排异反应术后第二个月,患儿就出院了。患儿的移植很成功,病情稳定。这是日本国内首次使用胚胎干细胞治疗人体疾病,也是世界首例使用胚胎干细胞诱导肝细胞的移植手术。

 

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肾脏疾病:肾元祖细胞

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是指各种肾脏疾病引起的缓慢进行性肾功能损害,最后导致尿毒症和肾功能完全丧失。由于捐献的肾源有限,绝大部分肾功能衰竭患者都只能依赖透析。在日本,大约有33万名透析患者其中约有7000人已经接受透析治疗超过30年。

 

肾移植是一种恢复肾功能的治疗方法,是终末期肾衰竭患者透析的替代方法。肾脏移植主要有尸体肾移植和活体供肾移植。在日本,来自捐赠者的肾移植比较少。日本每年进行肾移植的数量被限制在约1700例左右。比起美国每年进行的2万多例,相差甚远。因此,治疗肾脏疾病的再生医学正在被热切地期待之中。

iPSC细胞疗法在日本的临床研究

 种间肾脏再生技术图示

研究小组将的iPSC诱导分化为肾元祖细胞 (nephron progenitor cells, NPCs)体外培育成肾芽后再移植给正在接受人工透析治疗的肾衰竭患者。使用来自HLA-homo iPS 细胞库的肾元祖细胞,培育成肾芽,再分化诱导刺激形成肾小球和肾小管。由于肾脏被一层薄薄的胶囊覆盖,在动物实验中,研究团队将iPSC来源的NPCs注入肾实质和囊之间的空间,对缺血再灌注损伤诱导的急性肾衰竭小鼠模型有治疗作用。

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小结和展望

我们概述了日本使用基于iPSC进行的临床试验。虽然iPSC仍然面临诸多挑战,但仍不能阻挡其在细胞治疗和其他应用方面的巨大潜力。大量的科学家仍然持续在这一领域进行努力耕耘,不断克服剩余的障碍。

 

近年来,国内基于iPSC治疗的企业也如雨后春笋般兴起,纷纷申请开展IND或IIT,开始各种尝试,探索中国的iPSC治疗。在不久的将来,基于iPSC的细胞治疗技术将成为一项真正的临床选择,在全球范围内为病人带来福音

参考资料:

[1]  Current status and future directions of clinical applications using iPS cells—focus on Japan[J]. The FEBS Journal.
[2]Mandai M, Watanabe A, Kurimoto Y, Hirami Y,Morinaga C, Daimon T, Fujihara M, Akimaru H,Sakai N, Shibata Y et al. (2017) Autologous inducedstem-cellderived retinal cells for maculardegeneration. N Engl J Med 376, 10381046.
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