AML的CAR-T扩增方案

AML的CAR-T扩增方案

3.1AML患者的T细胞扩增

1.使用温T细胞培养基解冻AML患者的冷冻PBMC,以500 g离心7分钟以去除DMSO,然后重悬于T细胞培养基中。平板以1×106细胞/mL的浓度放置,并在37℃,5CO2的培养箱中静置过夜。

2.取一等份进行流式细胞术,用CD45CD3染色和活/死染色。使用流式细胞仪采集以确定T细胞的百分比和总数。

3.准备CD3/CD28 Dynabeads:计算出达到PBMC与总PBMC比例为3:1所需的珠子数量。轻轻地上下吹打一分钟,使珠子重悬。不要涡旋。在1.5 mL试管中的1 mL TCM中加入所需体积的珠子,然后轻轻重悬以进行洗涤。将试管放入磁体中(例如DynaMag-2Thermo Fisher Scientific)并等待1分钟。取出介质时不要干扰小珠。重复洗涤步骤三遍。洗涤后,将珠重悬于500-1000μLT细胞培养基中。

4.如果使用烧瓶,则将珠子以1×106细胞/mL的浓度加到已经接种的细胞中。如果计划使用板的多个单独的孔,则将珠子添加到锥形管中的细胞中,然后分配1 mL等分的细胞/珠子混合物。保持在37℃,5CO2的培养箱中。刺激的一天(将珠子添加到细胞中)代表第0天。

5.从第3天开始,隔天使用Coultermulti-sizer对细胞进行计数。用TCM培养细胞,使终浓度达到1×106细胞/mL

6.在第6天,按以下步骤除去珠子:通过上下移液几次轻轻重悬细胞,收集细胞,然后将其置于15 mL50 mL锥形管中。将试管放入磁铁(例如DynaMag-15Thermo Fisher Scientific)中,然后等待2分钟以使珠子移至侧面。用移液管吸出管中部的细胞悬液。以1×106/mL细胞的温热的TCM在新的烧瓶中重悬,使用Coulter多功能分选器和平板计数。

7.记录计数和平均细胞体积(MCV并绘制图形以生成增殖曲线(图1)。随着T细胞被激活,MCV增加,然后在激活后第5天到第7天达到最大值,然后随着T细胞开始休息而下降。

8.MCV达到300 fL,细胞已充分休息(通常在9-14天之内),可以用于以后的实验或冷冻。以10DMSO的速率控制方式在90%的胎牛血清中以10×106/mL的速度冷冻细胞。融化后的回收率应高于75%。

9.1代表5AML患者的T细胞扩增动力学。

 

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3.2AML患者在T细胞扩增前富集T细胞

1.我们发现残留的AML母细胞的存在会损害T细胞的扩增。通过流式细胞术分选将T细胞与AML分离,纯度达到100%。然后将T细胞与AML细胞以不同比例混合(图2a),进行刺激和扩增。AML细胞枯竭后,T细胞扩增有显着改善。

2.为了富集原代AML样品中的T细胞,可以进行CD3/CD28DynabeadsCD4/CD8阳性选择。

3.使用CD3/CD28磁珠富集T细胞:解冻,以1×106细胞/mL平板接种AML样品,静置过夜(如小标题3.1所述)。计数,准备和清洗珠子(如小标题3.1中所述)。将珠子添加到细胞中,将细胞放入15 mL50 mL锥形管中,并在室温下旋转45分钟进行孵育。在此期间,T细胞将与珠子紧密结合。将试管放入磁铁中,等待1分钟。珠子(以及连接到它们的T细胞)将迁移到侧面。从试管中心轻轻吸出培养基(此时该培养基主要含有AML细胞,而不是与CD3/CD28 Dynabeads结合的T细胞)。在TCM中重悬磁珠(和附着的T细胞),用Coulter多功能分选器计数,并以1×106细胞/mL的速度平板接种。取一等份用于流式细胞术(如小标题3.1中所述)。如小标题3.1所述,继续进行T细胞扩增。图2b代表CD3 / CD28富集后T细胞扩增曲线的一个例子。

4.使用CD4/CD8阳性选择富集T细胞:融化,以1×106细胞/mL平板接种AML样品,并在培养箱中于37℃过夜(如小标题3.1所述)。用与PE偶联的CD4CD8抗体染色,然后根据制造商的说明使用MACS富集抗PE微珠。选择T细胞后,如小标题3.1中所述刺激和扩增T细胞。

 

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3.3、从AML患者中产生慢病毒CART

1.如前所述[19]产生CAR慢病毒质粒。

2. CAR慢病毒是通过用特定质粒转染293 T细胞而产生的,如上所述[19],将上清液冷冻在-80℃下。

3.如小标题3.13.2中所述开始T细胞扩增。

4.在第1天,用慢病毒转导T细胞。在室温下逐渐解冻冷冻的慢病毒上清液20-30分钟。将先前滴定的慢病毒上清液以3.0的感染复数滴加到T细胞中。通过轻轻旋转平板来重悬。

5.在第6天,通过流式细胞仪检查CAR表达。取等分的T细胞,用流动缓冲液清洗一次,用抗CAR抗体染色和活/死染色,清洗两次,然后用小鼠抗人CD45CD3染色。在流式细胞仪上获取以确定转导效率。我们通常获得50-75%的转导效率。

6.继续执行小标题3.1中概述的其余扩展。

7.3代表从AML患者产生的CD123指导的CAR T细胞的实例。引入CAR转基因为T细胞提供了扩展优势(图3a)。

 

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3.4、从AML患者中产生RNA修饰的CAR T细胞

1.如小标题3.1所述,接种AML样品并开始T细胞扩增。

2.如前所述,将CAR慢病毒构建体亚克隆到pDA载体中[18]

3.使用mMESSAGE mMachineT7ULTRA转录试剂盒通过体外转录产生RNA。如前所述,使用RNeasy Mini Kit纯化RNA

4.MCV低于300 fL,可以用RNA电穿孔T细胞或将其在胎牛血清中与10DMSO冷冻,以备将来使用。

5. T细胞的电穿孔:如果使用冷冻的扩增T细胞,则在温热的TCM中融化,以500 g离心7分钟以去除DMSO,并在37℃,5CO2的培养箱中静置过夜。从现在开始,在冰上执行所有程序。

6.将细胞转移至50 mL锥形管中,并用冷OptiMEM洗涤3次。两次洗涤之间以500g的转速旋转7分钟。第三次清洗后,完全吸出上清液,并重悬于冷OptiMEM中,最高300×106细胞/mL。将T细胞转移至子弹管(100μL)(30×106 T细胞)至每个子弹管。加入RNA(每1×106 T细胞1μg),并通过上下移液几次轻轻重悬。将细胞和RNA从每个子弹管转移到比色皿中,并置于冰上。

7.开启ECM830电子方波发生器,将机器设置为500 V700μs。将比色杯放入机器中,牢固拧紧到位并脉动。用1 mL温热TCM清洗比色皿3次,并将细胞转移至六孔板中。加入T细胞培养基使浓度达到2×106细胞/mL。在37℃,5CO2的培养箱中培养。

8.电穿孔后将细胞静置2-4小时。然后可以使用细胞或将其冷冻以用于将来的实验。

AML的CAR-T扩增方案

T cell Media (TCM): X-vivo 15 media (Fisher Scientific),human serum 5% (GeminiBio-product, Inc., West Sacramento,CA, USA), penicillin, streptomycin (10,000U/mL, ThermoFisher Scientific), and glutaMAX (100×, Thermo Fisher Scientific).

 

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发布者:木木夕,转转请注明出处:https://www.cells88.com/myxb/8173.html

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