CAR-NK特定的CAR结构

在NK细胞中实施CAR技术通常使用优化用于诱导 T 细胞活化的构建体。尽管T细胞和 NK细胞之间的一些信号传导是保守的,即CD3ζ和4-1BB,但 CAR-T 细胞中常用的其他共刺激结构域以及TM结构域和铰链在NK细胞中完全不存在,即CD8α和CD28。此外,导致免疫突触形成和靶细胞随后细胞溶解的激活信号的差异是细胞类型特异性的。由于最有效的NK细胞亚群,即所谓的“连环杀手”,仍然无法从表型上识别出来,这使情况变得更加复杂。

CAR-NK特定的CAR结构

NK细胞上的激活受体利用多种衔接分子进行下游信号传导,包括 CD3ζ、DAP10、DAP12 和 FcRγ 链。虽然CD3ζ包含并通过3个基于免疫受体酪氨酸的激活基序 (ITAM) 域发出信号,但 DAP10、DAP12和FcRγ链各只包含一个ITAM域。

通过CD3ζ传递信号的NK细胞受体包括CD16、NKp30 和 NKp46,其中CD16和NKp46也通过FcRγ 链传递信号。

与DAP12相比,DAP10参与通过NKG2D介导信号传导DAP12充当激活KIR、NKG2C和NKp44的衔接蛋白。

CAR-NK特定的CAR结构

NK 特异性CAR构建体主要集中在将DAP10或DAP12作为激活域或作为与CD3ζ一起的共刺激域合并。DAP10的整合是成功的,但只能与NKG2D结合,符合内源性NKG2D信号。

第二代CAR构建体以NGK2D作为胞外域,DAP10和CD3ζ构成胞内域,在使用骨肉瘤异种移植小鼠模型进行体外和体内测试的原代NK细胞中表现出增加的表面表达和功能。

然而,另一种利用与4-1BB和DAP10融合的NKG2D TM结构域的针对PD-1的CAR构建体发现DAP10是多余的,缺乏DAP10的相同构建体显示出更好的NK细胞功能。这种抑制性CAR构建体旨在使用抑制性PD-1信号激活NK细胞,仅利用NKG2D作为TM结构域。

作为一种II型蛋白,与通常用于CAR构建体的I型膜蛋白(即CD8α和CD28)相比,NKG2D 的跨膜区有所不同。使用 II 型蛋白质作为 TM 结构域的额外挑战通过构建体的不良表面表达而变得明显。此外,确保构建体中NKG2D和DAP10之间的相互作用似乎是通过DAP10 包含构建体确定有效信号传导的主要因素。

另一项比较包含DAP10或CD3ζ的靶向CD19的第一代CAR的研究证实了这一点,其中CD3ζ 作为激活域的表现优于DAP10。

另一方面,在体外和体内小鼠研究中,DAP12在转导到原代NK细胞的第一代CAR中的表现优于 CD3ζ,无论使用哪种scFv。

NK 特异性CAR构建体的最大比较是在NK-92细胞中进行的,包括对四个不同跨膜结构域(CD16、NKp44、NKp46 和 NKG2D)和四个不同共刺激结构域(2B4、DAP10、DAP12、和 CD137)与 CD3ζ 的各种组合。只有三个构建体导致细胞溶解反应增加,选择包含 NKG2D TM 结构域和2B4共刺激结构域的构建体在iNK细胞中进行进一步分析。

NK-92细胞中作为共刺激结构域的2B4与4-1BB的另一个比较有利于含有2B4的CAR构建体,其诱导快速增殖,增加细胞因子产生和脱颗粒,并减少转导细胞中的细胞凋亡。2B4是信号淋巴细胞激活分子(SLAM)家族受体的成员,并结合CD48,通常由造血细胞表达。它通过其基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)发出信号,该基序在磷酸化后募集接头蛋白,例如SAP和EAT-2。

为了解决通常与注入的NK细胞相关的体内持续时间短的问题,Liu等人改造CB衍生的NK细胞以表达 IL-15。因此,CAR转导的细胞产生了它们自己的可溶性 IL-15,这足以维持42天的自主生长。然而,由于细胞因子释放综合征,将高剂量的表达CAR的CB衍生的 NK 细胞注入小鼠(Raji异种移植模型),在四只小鼠中被证明是致命的。为了预先排除这种致命副作用的可能性,作者还包括一个诱导性自杀基因作为安全措施。虽然由于IL-2和IL-15的副作用,对NK细胞输注的全身细胞因子支持是不利的,但工程细胞分泌细胞因子似乎也不是一个简单的解决方案。

  --CAR-NK细胞的临床试验--  

Clinicaltrials.gov 目前有 6 个 CAR-NK 细胞试验被列为积极招募和 6 个尚未积极招募的早期 I 期临床试验(表 1)。虽然许多试验侧重于淋巴瘤和白血病,但其他试验则针对实体肿瘤,包括卵巢癌、前列腺癌、脑癌、肝癌、肺癌和胰腺癌。

CAR-NK特定的CAR结构

已经报道了针对 CD33 或 NKG2D 配体的 NK-92 和原代 CAR-NK 细胞的小规模临床试验(n=3)的结果,但第一次大规模 I/II期临床试验直到最近2020 年 2 月发表。11名复发性或难治性慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 或非霍奇金淋巴瘤患者在接受环磷酰胺/氟达拉滨的标准淋巴细胞清除治疗后,接受了异基因CB衍生的 CAR-NK细胞产品。尽管最初根据部分 HLA 匹配 (4/6) 选择供体 NK 细胞,但 GvHD的缺失导致供体标准侧重于 KIR 配体错配,而没有考虑到最后两名患者的 HLA 匹配。不幸的是,接受KIR配体错配产品的捐赠者数量太少,无法得出任何结论。

消除对HLA匹配的需求凸显了生产真正现成产品的可能性,尽管产品在冷冻/解冻循环后的生存能力和效力仍需进行临床测试。CAR产品的短制造时间使每位患者能够在参加临床研究后的 2 周内获得单独制造的临床产品。11名患者中有 8名对治疗有反应,其中7名患者完全缓解。高反应率和无严重副作用,如CRS、GvHD和神经毒性,证明了 CAR-NK细胞作为有前途的新型癌症免疫疗法的可行性和有效性。

与之前发表的体外研究相比,在产生IL-15的CAR-NK细胞的上清液中检测到IL-15水平升高,维持细胞自主生长,治疗患者的血清 IL-15水平没有超过基线水平 。通过流式细胞术检测循环中的CAR-NK细胞仅限于前14天,并且在供体之间变化很大。定量PCR用于载体转基因的长期检测,尽管这仅与前14天接受的治疗剂量相关。虽然无法评估CAR-NK细胞疗法的持久性,但由于在最初的30天后允许进行缓解巩固疗法,对疗法有反应的患者表现出明显更高的CAR-NK细胞早期扩增。考虑到疾病的严重性和这些患者之前经历的多轮失败的化疗,11名患者中有8名的反应率是巨大的成功。

  --CAR-NK细胞中的内源性信号传导--  

自身MHC-I分子的抑制性受体连接通过调节溶酶体区室来微调NK细胞的功能潜力,导致颗粒酶B保留在细胞毒性颗粒中。接受过来自同源配体的抑制性受体输入的受过教育的NK细胞与未受过教育的NK细胞相比,在接受足够的激活受体输入后表现出增加的功能潜力。教育幼稚NK细胞的主要抑制性受体是NKG2A和KIR。NKG2A介导的抑制最终在成熟过程中被更强的KIR介导的抑制所取代]。

Oei等人已经解决了CAR信号是否足够强以克服内源性抑制信号的问题。事实上,表达CAR的NKG2A+ NK细胞能够克服HLA-E介导的抑制并有效裂解721.221-AEH 细胞。然而,KIR介导的抑制作用并非如此,肿瘤细胞上的同源自配体表达抑制了表达CAR的NK细胞的溶细胞反应。虽然CAR表达增加了对表达抗原的靶细胞的功能反应,但维持了受过教育和未受过教育的细胞之间的功能层次结构。因此,选择功能性NK细胞起始群体对于最大化抗肿瘤效果非常有利。

CAR-T 细胞疗法在临床上对表达CD19的淋巴瘤的成功促进了CAR-NK细胞领域的快速发展。T细胞和NK细胞之间导致细胞活化的生物学和分子机制大不相同,因此在设计 CAR-NK 细胞构建体时需要考虑。表达CD16的 CAR-NK 细胞与单克隆抗体治疗的联合治疗是通过靶点特异性裂解和ADCC充分利用NK细胞的细胞毒性潜力的一种可能性。

基因工程原代 NK 细胞的挑战导致许多研究和临床试验正在使用NK-92细胞进行。新方法的开发和现有技术的优化将促进更有效的原代NK细胞基因工程,使原代NK细胞能够取代目前正在临床测试的主要 NK-92 CAR产品。

最后,如果持久性问题能够得到解决,无论是通过对构建体的额外工程设计,还是通过进一步了解持续NK细胞增殖的要求,CAR-NK疗法将具有巨大的潜力作为一种新的抗癌免疫疗法。

 

发布者:木木夕,转转请注明出处:https://www.cells88.com/myxb/4597.html

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