Nature子刊 | 中科院新方法可大规模再生NK细胞，助力免疫治疗！

iNK细胞高度表达经典的毒性颗粒蛋白、诱导凋亡的配体以及丰富的激活和抑制受体。在功能上，iNK细胞通过直接细胞毒性、凋亡和抗体依赖性细胞毒性等机制清除人类肿瘤细胞。本研究提供了一种可靠的从hPSCs中大规模再生人类NK细胞的方法，促进了NK细胞产品在免疫治疗中的普遍应用。

在培养皿中进行造血诱导的一个典型现象是，缺乏淋巴样潜能的原始造血祖细胞（HPCs）总是占主导地位。天然胚胎中决定性的造血细胞命运经历了LPM形成、造血内皮细胞（HEC）、内皮细胞向造血细胞转化（EHT）以及决定性的造血祖细胞出现等一系列事件。为了解决NK淋巴生成效率低的问题，该团队结合优化策略，建立了一个从hPSCs再生NK细胞的方案，其中包括逐步生成丰富的早期LPM细胞，HECs，HPCs，和成熟的NK细胞。实验结果显示，hPSCs在培养皿中分化的第一天开始迁移，并高度表达TBXT。第二天，细胞迅速增殖，并表达LPM标志物APLNR和HAND1。流式细胞术分析结果显示，分化第一天有>60%的细胞表达BRACHYURY蛋白，该蛋白由TBXT基因编码。在分化的第二天，>90%的细胞表达APLNR。此外，一个hPSC平均可以输出5.1±0.4（平均值±SD）的诱导侧板中胚层（iLPM）细胞。因此，在48小时的单层诱导中，iLPM细胞是由hPSCs有效产生的（图1）。

研究团队将iLPM细胞和OP9饲养细胞结合起来，在第2天制备类器官聚集体。第3天、第16天和第27天的类器官聚合体的图像如图2。此外，观察到第9天出现了大量的诱导性造血内皮细胞（ iHECs, CD144+ 在CD73-DLL4+CD31+CD34+: > 93.6% ），第16天出现了诱导性造血祖细胞（ iHPCs, CD43+在 CD235a-CD45+CD34+: > 97.3% ）。在第27天，97.4%±2.6%（平均±SD）的细胞（ CD45+CD3-CD56+CD16+/-）已经显示出终端成熟NK细胞表型，被定义为诱导NK（iNK）细胞。从形态上看，ESC-iNK细胞和iPSC-iNK细胞与活化的脐带血NK（UCB-NK）细胞类似。据统计，类器官聚集体在第27天产生了3.5±0.4（平均值±SD）万个CD56+iNK细胞，在第30天达到410（中位数）万个。团队测试了来自六个人的hPSC系，所有这些干细胞系都能重现产生丰富的iNK细胞（P 平均来说，一个hPSC在第27天可以输出983.6±32.4（平均值±SD）个iNK细胞。有趣的是，残留的OP9饲养细胞在第20天急剧减少，在第30天几乎检测不到（P 。

此外，团队发现OP9衍生的细胞系的类器官聚集显示了可对比iNK细胞的再生效率。因此该团队进一步用OP9或OP9-hDLL4作为供体细胞进行并列实验，并评估ESC和iPSCs的iNK细胞的诱导效率、成熟度和细胞毒性。OP9和OP9-hDLL4都支持iNK细胞（CD45+CD3-CD56+）在第27天有效成熟。同时使用来自OP9和OP9-hDLL4饲养组的iNK细胞，从相同的干细胞系开始进行抗肿瘤活性检测。结果显示来自OP9和OP9-hDLL4组的iNK细胞对卵巢肿瘤细胞系A1847和白血病细胞系K562表现出类似的肿瘤杀伤活性。总之，一个类器官集合系统有效地支持从LPM细胞开始的NK细胞再生。

为了说明iNK细胞的分子特征，该团队对iNK细胞和自然对照NK细胞（UCB-NK细胞）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。激活性受体和抑制性受体的表达模式决定了NK细胞的激活状态和功能。正如预期的那样，ESC-iNK细胞和iPSC-iNK细胞都表达了经典的激活性和抑制性受体基因，包括激活性受体基因NCR3、NCR2、KLRK1和SLAMF7，以及抑制性受体基因KLRC1和CD96。II型跨膜蛋白CD94与NKG2A二聚形成CD94/NKG2A异二聚体，识别非经典的HLA-E I类分子并抑制信号激活，或与NKG2C结合形成CD94/NKG2C受体，传递激活信号并促进NK细胞的激活。此外，iNK细胞也高度表达基本的效应分子，包括与凋亡有关的配体（TRAIL和FasL）、细胞毒颗粒（GzmB和穿孔蛋白）、激活分子CD69。

此外，对ESC和iPSCs诱导的NK细胞进行了10×scRNA-seq分析，并与自然静止的NK细胞和来自人类外周血的活化NK细胞进行了转录组比较。数据显示，ESC和iPSC诱导的iNK细胞与人类外周血中的活化NK细胞有很好的投影。与自然激活的NK细胞类似，从ESC和iPSC细胞衍生的iNK细胞之间没有明显的异质性。然而，在人类外周血的静止NK细胞中确实观察到了异质性的NK细胞群，这与来自ESCs、iPSCs或人类外周血的活化NK细胞都不同。此外，iNK细胞在PMA/ionomycin、K562肿瘤细胞或IL-2的存在下可以产生IFN-γ和TNF-α（图3）。总体而言，iNK细胞表达典型的NK细胞标记和效应分子。

与适应性T细胞不同，NK细胞可以直接识别并杀死HLA I类（MHC-I）表达下调的肿瘤细胞。因此，该团队选择了对NK细胞敏感的人类卵巢癌细胞系A1847（ tdTomato+）来验证iNK细胞的肿瘤杀伤能力。将ESC-iNK细胞、iPSC-iNK细胞和UCB-NK细胞按梯度剂量分别与A1847-tdTomato+肿瘤细胞共同培养。正如预期的那样，所有三种来源的NK细胞都能有效地针对A1847细胞，并在4小时内导致肿瘤细胞凋亡（图4）。NK细胞可以通过ADCC机制增强肿瘤杀伤力。为了研究iNK细胞的ADCC能力，将抗CD20抗体（利妥昔单抗）与iNK细胞在不同的E：T比例（1：1，2：1，5：1，和10：1）下联合起来杀死CD20+人类淋巴瘤细胞系Raji。正如预期的那样，抗CD20抗体进一步增强了iNK细胞对Raji肿瘤细胞的杀伤活性（图4）。综上所述，来自hPSCs的iNK细胞通过直接作用和ADCC方式杀伤肿瘤。

为了评估iNK细胞在体内的治疗潜力，在第1天将A1847（A1847-luci+）细胞移植到NCG小鼠体内，然后，在第0天和第7天将iNK细胞腹腔注射到小鼠体内。同时，UCB-NK细胞被用作天然NK细胞治疗对照。每两天注射一次IL-2，直到第21天，以加强动物体内iNK细胞的维持。每周用小动物成像系统记录肿瘤生长的趋势（图5）。事实上，ESC-iNK细胞和iPSC-iNK细胞都能有效地消除体内的肿瘤细胞，并表现出与天然UCB-NK对照组相当的肿瘤杀伤效率。同时，如辐射度和总通量值所示，纯瘤组的肿瘤负担越来越严重（图5），最终该组小鼠在注射A1847-luci+细胞后的第37天和第41天之间由于肿瘤负担严重而需要进行安乐死。ESC-iNK细胞处理的小鼠和iPSC-iNK细胞处理的小鼠的存活时间明显长于仅有肿瘤的对照小鼠（仅有肿瘤：38天；肿瘤+UCB-NK：>87天；肿瘤+iPSC-iNK：> 82天；肿瘤+ ESC-iNK：>120天；P

此外，iNK细胞疗法治疗的肿瘤动物恢复了正常体重。为了验证iNK细胞是否对不同类型的肿瘤表现出抗肿瘤活性，研究组进一步用急性髓系白血病（AML）模型测试了iNK细胞的杀伤力。结果显示与未治疗的对照组相比，人类ESC衍生的iNK细胞和对照组的PB-NK细胞都能明显抑制AML肿瘤的生长（图6）。此外，ESC-iNK治疗组的肿瘤小鼠的中位生存期明显延长。总之，这些结果表明，ESC或iPSC衍生的iNK细胞可以有效地杀死肿瘤细胞，延长肿瘤动物的生存期。

在这项研究中，研究团队开发了一种无EB的类器官聚合方法，用于从hPSCs中再生NK细胞。在27天的短暂诱导时间内，100万hPSC输入可以输出超过10亿个iNK细胞，而不需要NK细胞扩增供体。

在功能上，这些iNK细胞在移植人类肿瘤细胞的动物模型中表现出强大的抗肿瘤活性。在分子水平上，iNK细胞显示了天然NK细胞对应的激活和抑制受体、细胞毒性分子和细胞凋亡相关配体的典型表达模式。从机制上看，iNK细胞具有通过典型的细胞毒性、ADCC和细胞凋亡机制杀死人类肿瘤细胞的能力。该研究提供了一种制造大规模"现成的" NK细胞产品用于免疫治疗的方法。