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学习|外泌体概述

2023-07-26 10:23 • 外泌体应用 • 阅读 30171

外泌体是大多数细胞分泌的一种微小囊泡。它具有脂质双层结构，分布在外周血、尿液、唾液、腹水、羊水和其他体液中。外泌体携带蛋白质、脂质、核酸等重要信息，尤其是非编码RNA（miRNA、lncRNA、circRNA等），使其更有意义。外泌体不仅在细胞间物质和信息传递中发挥重要作用，而且有望成为多种疾病的早期诊断标志物。外泌体RNA测序可以快速高效地获得外泌体RNA的全面信息，是疾病诊断和随访的理想手段。目前，基于外泌体的RNA研究主要集中在miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA等类型。

关于外泌体分离方法，包括传统的差速离心、密度梯度离心，以及后来开发的超滤、聚合物沉淀、免疫分离、分离筛选、体积排阻色谱等。

细胞外囊泡（EV）生物发生、亚群、外泌体分离方法（Karim Sidhom 等人，2020 年）

一、差示超速离心

差速离心仍然是最常见的外泌体分离技术之一。该方法包括几个步骤，包括：

1.低速离心以去除细胞和凋亡片段。

2更高速的离心以消除较大的囊泡。

3高速离心沉淀外泌体。

可以从细胞培养上清液、血清、血浆、尿液、脑脊液和其他体液（腹水、羊水、乳液、唾液等）中提取外泌体，得到的高纯度外泌体颗粒可用于后续的NTA、TEM、WB分析等。

二、体积排阻色谱（SEC）

根据体积排阻色谱法，SEC根据大小而不是分子量分离大分子。该技术使用填充有多孔聚合物微球的色谱柱。分子根据其直径在微球中移动。半径较小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而较大的分子则更早地从色谱柱中洗脱出来。SEC已被证明比离心具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响。目前，SEC是一种被广泛接受的从血液和尿液中分离外泌体的技术。我们有一套基于色谱法的标准程序用于外泌体的提取和纯化，以确保高回收率。

三、基于聚乙二醇（PEG）的沉淀

生物体液中的外泌体沉淀可以通过改变其溶解度或分散性来实现。通常，样品与含有PEG的沉淀溶液一起孵育，该沉淀溶液迫使可溶性较低的组分从溶液中排出。含有外泌体的沉淀在孵育过夜后通过低速离心或过滤分离。该方法易于使用，不需要专门的设备，而且可以针对大量样品进行扩展。可根据您的要求提供多种沉淀套件。

四、密度梯度离心（DGC）

密度梯度离心是指超离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体与非囊泡颗粒（如蛋白质和蛋白质/RNA聚集体）的分离。因此，该方法将囊泡与不同密度的颗粒分离，并能够提取低含量的外泌体。然而，适当的离心时间很重要，否则，如果外泌体具有相似的密度，它们仍然可以在外泌体中找到污染物颗粒。

五、免疫亲和力（IA）

使用涂有抗体的磁珠进行免疫亲和捕获，抗体靶向外泌体表面蛋白以分离特定的囊泡群。实验程序包括样品处理、磁珠孵育和结合、低速离心和分离外泌体的生物学分析。

六、微流体（MF）

微流体（MF）技术使用具有特异性抗体介导结合的芯片来捕获外泌体。基于微流体的技术可用于具有特定表面标志物的外泌体分离（微流体与免疫亲和捕获相结合）和具有特定大小群体的外泌体分离（微流体结合膜过滤）。

七、超滤

超滤（UF）依赖于具有不同孔径的过滤器，该过滤器用于将外泌体与蛋白质和其他大分子分离。

文献：

1.Karim Sidhom, et al. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option? Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6466.

2.Yong Kyoung Yoo, et al. Toward exosome-based neuronal diagnostic devices. Micromachines (Basel). 2018, 9(12): 634.

3.Kang Li, et al. Cushioned-density gradient ultracentrifugation (C-DGUC): a refined and high performance method for the isolation, characterization, and use of exosomes. Methods Mol Biol. 2018, 1740: 69-83.

4.Shang-Chun Guo et al. Microfluidics-based on-a-chip systems for isolating and analysing extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2018, 7(1): 1508271.

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