信不信？高效分离外泌体，几小时就能搞定！附外泌体数据库

外泌体是包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制则刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。无论是对其功能，还是对如何将其用于微创诊断的开发的研究都日益增长。

外泌体的功能

研究发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。外泌体具有脂质双层膜结构，能很好的保护其包被的物质，且能靶向特定细胞或组织，因此是一种很好靶向给药系统。

外泌体中包含多种成分，如蛋白质、脂质、RNA，其中RNA种类有：mRNA、miRNA及其他非编码RNA。

具体功能：

•有助于细胞成熟过程中等离子体膜蛋白的移动

•传递大分子信息(RNA和蛋白质)，使细胞间信息传递

•促进免疫反应、抗原呈递、程序性细胞死亡、血管生成、炎症反应、凝聚

•肿瘤细胞分泌的外泌体可促进致癌基因的传播

•在极性产物的生长和分化期间形成转运蛋白

•朊病毒等病原体的传播以及病毒的细胞间传播

•通过分泌化学诱导信号帮助网柄菌细胞迁移

•母乳中包含miRNA的外泌体，有助于增强婴儿免疫系统

近年来，关于外泌体的研究与应用十分热门，今天小编就来给大家普及一下外泌体研究中的第一步：如何高效提取分离外泌体？以及分享一些外泌体数据库。

超速离心法是目前最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将大小相同的囊泡从样本中沉淀并纯化出来。

外泌体超速离心一般和蔗糖密度梯度离心或蔗糖衬垫组合起来分离低丰度外泌体。需在离心机中以100,000-200,000 x g离心沉淀（含有外泌体）120分钟，使样品中的外泌体在1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范围内进行富集。

尽管这种联合的方法可以获得高度纯化的外泌体，但也存在一些缺点。例如同批次最多只能同时处理6个样本（转子限制）且回收率不稳定，前期需要准备大量材料且外泌体得率低。

最重要的是重复离心很可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量，并且一些可溶性蛋白可与外泌体形成团块而产生污染。

超滤离心法是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。

这种方法比较简单高效，也不影响外泌体的生物活性，但缺点是外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。此外，截留在膜上的外泌体间也会发生粘附，导致产量降低。

Tips：外泌体是直径30~100 nm囊状小体，大于一般蛋白质。采用此方法需要考虑到与外泌体大小相似的其他囊泡的干扰。

聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早期应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。在4℃利用PEG孵育后通过过滤或离心即可沉淀、回收外泌体。

采用此种分离方法也存在不少问题：纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。

外泌体表面有其特异性标记物（如CD9，CD81，CD63，CD82，Hsp70，Ras相关蛋白Rab-5b，细胞骨架蛋白肌动蛋白和TSG101等），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。

因为外泌体的异质性与它们的起源一致，不同外泌体上的标记物丰度也不同，通过特定的抗体组合可以从样本中捕获不同类型的外泌体，进行选择性分离。

磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

其他方法（近期文献报道）

①交流电动（alternating current electrokinetic，ACE）微阵列芯片装置：简称ACE芯片，该芯片的单个电极的侧视图和俯视图如下所示，一个设备中有超过1000个电极，其表面涂覆薄薄一层多孔水凝胶，图中虚线所示DEP高场区即外泌体被富集的位置。在芯片电极处被富集的外泌体可直接用扫描电子显微镜（SEM）和免疫荧光等方法进行分析与鉴定。

该装置可以从未稀释的人血浆样品中快速分离获取外泌体，需要的样品量小，在15分钟内将外泌体集中到微电极周围的高场区域。洗涤去除大量血浆物质后，使外泌体浓缩在微电极上。分离、洗涤及芯片荧光分析步骤在30分钟内就可以完成。

参考文献：Ibsen SD, Wright J, Lewis JM, et al. Rapid Isolation and Detection of Exosomes and Associated Biomarkers from Plasma[J]. ACS nano, 2017.

②基于新型声波流体技术（acoustofluidic technology）开发的声波筛选装置：细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成。

两个声换能器生产的声波相互接触所形成的驻波会生成一系列压力节点。当细胞或粒子流过通道并遇到一个节点时，压力会引导细胞稍微偏离中心，细胞位移的距离取决于细胞大小和可压缩性等其他性质。

为了分离外泌体，研究人员将2个上述装置串联。第一个装置用来去除血液样本中的细胞和血小板，第二个装置的声波频率较高，可以把剩余血液样本中的更小的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来。利用这种装置完成100ml稀释血液样本的筛选工作用时不到25分钟。

参考文献：Wu M, Ouyang Y, Wang Z, et al. Isolation of exosomes from whole blood by integrating acoustics and microfluidics.[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, 114(40):201709210.

外泌体的研究方向包括基础机制研究及临床应用研究，涉及肿瘤、免疫、代谢、神经调控等多个领域。在临床诊断和治疗方面展现出了极具前景的研究价值，因此也是近年来的研究热点之一。本着便利、全面、高效的原则，来看看外泌体的数据库大汇总吧！

EVmiRNA

EVmiRNA

EVmiRNA数据库，是一个专用于细胞外囊泡（EVs）的miRNA数据库。里面包括miRNA表达谱，miRNA相关药物，miRNA调控途径，miRNA功能以及相关出版物。收录了17种器官或疾病462个EVs小RNA测序样本miRNA表达谱。EVmiRNA提供了三个功能模块：

(1)不同来源(如血液、母乳等)的miRNA表达谱和样本信息；

(2)在不同EVS中特异表达的miRNA，有助于生物标志物的识别；

(3)miRNA注释，包括miRNA在EVS和TCGA中的表达，miRNA途径的调控，以及miRNA的功能和出版物。

02

exoRBase

exorbase.org/

exoRBase是从人类血液外泌体的RNA-seq数据分析得出的环状RNA（circRNA），长非编码RNA（lncRNA）和信使RNA（mRNA）的存储库。exoRBase旨在收集和表征人血外泌体中的所有长RNA种类来提供注释，表达水平和可能的原始组织，识别血液外泌体中的分子标记，并将触发新的循环生物标志物发现以及对人类疾病的功能预测。

03

ExoCarta

exocarta.org/

ExoCarta是首个外泌体标志物综合数据库，针对外泌体中鉴定出的蛋白质和RNA分子数据库由Simpson教授团队建立，收录了包括人、大鼠、小鼠、绵羊、豚鼠、果蝇、马、穴兔、牛在内的几个物种共286个研究结果。除此之外，ExoCarta的一个典型特点就是具有外泌体蛋白动态的蛋白与蛋白之间相互关系网以生物学通路。

04

EV-TRACK

evtrack.org

EV-TRACK是以Thery为首的EV-TRACK联盟建立的EVs（EVs细胞外囊泡主要分为外泌体、微囊泡（microvesicles，MV）和凋亡小体三大类）研究报告数据库，其中包含了EVs相关文献的方法学参数，基于MISEV（EVs研究最小实验要求）评估EVs分离及鉴定相关参数。该数据库的建立旨在规范EVs研究，便于将实验规范应用于实际研究中，对实验结果进行解释，目前的数据包括了1502个出版物和2660个实验，且每年都在不停的更新中。

05

EMBL-EBI QuickGO

ebi.ac.uk/QuickGO/

QuickGO数据库一款针对人类蛋白GO功能分析的综合注释数据库，和实验室研究人员及外泌体数据库Exocarta 和Vesiclepedia是有紧密合作，其中有识别用于注释的靶蛋白以及外泌体实验方法学的注释，外泌体蛋白功能注释。而且外来基因本体论注释倡议就是由EBI的UniProt策划人发起，通过阅读文献并为这些蛋白指定描述其生物学作用的术语，将GO注释分配给人类外泌体蛋白。之前有专用于exosome的小库，但现在网页已经失效了，相关数据也综合到了QuickGO里。

06

Vesiclepedia

microvesicles.org/

Vesiclepedia是一个EVs分子数据（脂质、RNA和蛋白质）的数据库，目前包含来自于过去一些年份文献中发表的341个独立研究的35264个蛋白，18718个mRNA，1772个miRNA、342个脂质条目，Apoptotic blebs凋亡小泡、Exosomes 外泌体、Microparticles 微粒体 、Microvesicles 微囊泡都囊括在内。还可以根据物种、囊泡、分子和样品类型浏览和检索，这些条目来自过去几年发表的341项独立研究。

07

Urinary Exosome Protein Database

hpcwebapps.cit.nih.gov/

Urinary Exosome Protein Database是专用于尿液外泌体蛋白的数据库， 库内有1160种蛋白质，里面的数据是基于上皮系统生物实验室（ESBL）已发表的蛋白质谱数据，所有数据均来源于健康志愿者尿液外泌体。这个数据库包含了用两种不同的质谱仪来鉴定人类尿外泌体的蛋白质。

08

exRNA Atlas

exrna-atlas.org/exat

exRNA Atlas是ERCC联盟的数据库，有6627个数据。exRNA Atlas是细胞外RNA通讯联盟（ERCC）的数据库。该信息库包括人类和小鼠生物流体的小分子RNA测序和qPCR衍生的exRNA图谱，数据库使用exceRpt小RNA-seq管道的版本4处理所有RNA-seq数据集，并且ERCC开发的质量指标被统一应用于这些数据集。具体来说囊括了脑脊液、唾液、血清、血浆和尿液来源的5,309例 exRNA-seq 以及qPCR数据，同时网站还提供了适用于exRNA研究的分析工具。

09

miRandola

mirandola.iit.cnr.it/

miRandola是对各种细胞外循环非编码RNA类型进行全面的人工分类的数据库。非编码RNA以高度稳定的细胞外形式在血液中循环，在调节各种生物过程中起重要作用，因此它们可用作基于血液的生物标记。miRandola数据库目前有314条3283个条目，7种细胞外RNA形式，1002个microRNA，12个长非编码RNA，8个环状RNA，最重要的是对Vesiclepedia和ExoCarta miRNA数据整合。

参考文献：

1. Progress in Exosome Isolation Techniques（doi: 10.7150/thno.18133）

2. https://bitesizebio.com/37981/beginners-guide-hunting-exosomes/