学习|类器官纸上谈兵系列:3D 类器官与基质胶

类器官在培养过程中大多数需要基质胶支撑以形成3D结构,最常用的基质胶莫过于matrigel了。

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Matrigel是EHS小鼠肉瘤提取物,广泛的用于类器官的培养,甚至猪马牛羊兔等动物的类器官也是采用matrigel,这说明了什么呢?说明多细胞生物细胞之间的结合方式,在进化上是非常保守的,可以跨越物种的限制。但是基质胶并非只有matrigel一种选择,除了matrigel常见的BME 基底膜提取物,还有lammin,I 、II IV胶原等,也广泛的应用于类器官的培养。

类器官除了应用于研究发育,肿瘤药筛等热门领域之外,组织再生和修复等再生医学应用才是类器官研究的初心。mouse来源的matrigel,就成为构建无动物源成分培养体系的绊脚石。其成分的不明确和肿瘤来源,也很难应用于临床。

因此很多研究者开启脑洞,研究和尝试了多种多样的基质胶,可以分为以下三类

一 组织去细胞化的基质胶

(Giobbe et al., 2019)等用猪小肠脱细胞制备水凝胶基质,与matrigel相比,可以更好的支持内胚层类器官的生长与扩增,例如胃,肠道,肝脏,胰腺等类器官。

猪小肠来源的水凝胶用来培养肠道类器官,想想都非常有道理。虽然也是动物来源,但是猪小肠材料容易获得,产量高,而且不是肿瘤来源,自然有很大的优势。同时还能做到GMP的生产规范。

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用猪小肠制备ECM基质的基本流程

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猪小肠ECM基质与matrigel、BME基质的在类器官培养中的对比

(Meran et al., 2020)等则更进一步,直接用手术切除的人类小肠,制备了脱细胞的基质胶,用于大规模扩增人类小肠类器官,经过8周时间可以获得一千万细胞,并对小肠类器官移植进行了概念性的验证。

(Simsa et al., 2021)等用猪脑子脱细胞制备的基质胶制备脑类器官,两个团队不约而同的选中了猪的组织来制备基质胶,未来二师兄在类器官中的作用不可限量。

理论上猪脑制备的基质胶含有神经系统的各种蛋白和信号,比matrigel更加适合脑类器官的生长。作者的结果表明,两种基质胶产生的脑类器官基因表达谱和分化结果非常的相似。

说明了什么?基质胶在PSC分化产生脑类器官的过程中,作用不是那么的重要和关键。这也是一件好事,不管是科研和临床应用,研究者会拥有更多的选择。同时猪脑子来源的基质胶的产量和成本远比matrigel低多了。

与其他组织相比,天然大脑的ECM基质胶组成成分有较大差异。例如含有更少的纤维结构蛋白,例如胶原和弹性蛋白,有更多的蛋白多糖。蛋白多糖通过对细胞粘附和神经突触生长的调控,对神经元细胞的行为有深刻的影响。

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猪脑子制备的基质胶与matrigel 培养脑类器官的对比

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与matrigel相比,猪脑子ECM的脑类器官看起来似乎层次更加清晰。

(Zafeiriou et al., 2020)等用I 型collagen胶原作为基质制备了脑类器官,这篇文章的重点不是基质胶。作者之所以不用matrigel,是想建立成分完全明确的培养体系。由此可见matrigel多么不受待见。

二 植物来源的基质胶

(Curvello et al., 2021) 等用0.1%的植物纳米纤维素的基质胶成功的培养了小肠类器官,我想作者之所以写纳米纤维素纯粹是为了显得更加有高科技的感觉。作者指出matrigel的批次间一致性只有50%,实在是我没有预计到的。

作者之所以独树一帜的用植物纤维素制备基质胶的另外一个原因,是其他的方案都有人探索过,而植物的方案还极少有人探索研究。这也算为了追求创新性无所不用其极。

与下面的PEG方案类似,作者也用了纤连蛋白RGD基团,以提升细胞间的相互作用和粘附。

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三 人工合成的大分子聚合物基质胶

上面讲到的脱细胞制备的基质胶、胶原、matrigel等,都是动物来源,不适合临床的应用。最起码残存的动物蛋白成分会引起宿主的免疫反应。

而(Sorrentino et al., 2020)等用PEG作为骨架,整合肝脏中发现的关键ECM蛋白,如laminin-111,IV型胶原,纤连蛋白,制备了完全化学合成的基质,并且成功的用于肝脏类器官的培养。

完全化学合成的好处是可以试验很多条件,如把全长的纤连蛋白替换成整合素识别的肽段RGDSPG,可以有类似的结果。

另外一个有意思的发现是,matrigel培养6天左右在各种因素的作用下就会变软、结构恶化,但是PEG凝胶基质可以稳定的培养肝脏类器官14天以上。

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PEG基质的肝脏类器官,但从染色来看,背景干净很多 

(Jowett et al., 2021, p. 1)等利用了人工合成PEG基质胶可以调节硬度stiffness的优势,利用ILC1和小鼠肠道类器官共培养体系,研究了稀有细胞ILC1对细胞外基质的重塑,以及对微环境的影响。

这种成分明确的简单体系,可以排除很多干扰和扰动,让ILC1或者其他细胞对肠道上皮的作用明确的显现出来,不至于被淹没在噪声之中。

当然这种体系缺少了多种细胞和因素之间的相互作用。但是科学就是从简单到复杂,直接上来就研究复杂体系,面对一个黑匣子,可能永远也弄不清楚。

文章小结

基质胶作为3D类器官培养必不可少的材料,一直没有引起多大重视,大部分人因循守旧采用matrigel,有远见的科学家为了将来的再生医学应用,已经开展了各式各样的探索,并且发了很nice的paper。

当然也有很多文章采用了matrigel之外的BME基质,如cultrex,geltrex等,虽然没有深究其来源,大约的猜测是和matrigel类似,至少也是动物源性的基质胶,因为也有growth factor reduced生长因子减量等字样。

1 用相应组织脱细胞制作的基质胶培养对应的类器官,理论完美,完全匹配组织微环境的各种因子和蛋白,甚至ECM蛋白与结构也是完美匹配。结果也非常好。

2 大分子PEG人工合成的基质胶,成分完全可控,硬度和软度也完全可控。因此在研究机械性能对类器官的影响有独特的优势。

3 植物纤维素的方案,与PEG类似,成本极低。

参考文献

Giobbe, G. G. et al. (2019) ‘Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture’, Nature Communications, 10(1), p. 5658. doi: 10.1038/s41467-019-13605-4.

Simsa, R. et al. (2021) ‘Brain organoid formation on decellularized porcine brain ECM hydrogels’, PLOS ONE, 16(1), p. e0245685. doi: 10.1371/journal.pone.0245685.

Zafeiriou, M.-P. et al. (2020) ‘Developmental GABA polarity switch and neuronal plasticity in Bioengineered Neuronal Organoids’, Nature Communications, 11(1), p. 3791. doi: 10.1038/s41467-020-17521-w.

Curvello, R. et al. (2021) ‘Engineered Plant‐Based Nanocellulose Hydrogel for Small Intestinal Organoid Growth’, Advanced Science, 8(1), p. 2002135. doi: 10.1002/advs.202002135.

Jowett, G. M. et al. (2021) ‘ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling’, Nature Materials, 20(2), pp. 250–259. doi: 10.1038/s41563-020-0783-8.

Meran, L. et al. (2020) ‘Engineering transplantable jejunal mucosal grafts using patient-derived organoids from children with intestinal failure’, Nature Medicine, 26(10), pp. 1593–1601. doi: 10.1038/s41591-020-1024-z.

Sorrentino, G. et al. (2020) ‘Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation’, Nature Communications, 11(1), p. 3416. doi: 10.1038/s41467-020-17161-0.

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