外泌体是如何获得的

 

外泌体提纯方式

随着近年来大家对外泌体的认识和了解,外泌体也吸引了诸多科学家的注意,因其能够为癌症早期诊断和治疗提供有意义的生物标记物。那么对于外泌体分离纯化一直是科研工作者关注的问题,获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解,外泌体的提取方法有多种:包括传统的差速离心、密度梯度离心,以及后来发展的超滤法、沉淀法、免疫分离、微流控、磁珠免疫法等。这些方法各有利弊:

一、离心法

1、差速离心是从生物体液或细胞上清分离外泌体的金标准方法。采用低速离心、高速离心交替进行,可分离到大小相近的囊泡颗粒。目前在国外的重要期刊如Cell、Nature、Science以及其众多子刊中,差速离心是普遍应用的经典技术手段。

差速离心获取的外泌体纯度更高,均一性更好,具有更小的粒径,但相对于PEG-base沉淀法,差速离心法的产量不高。二者都是实验室常用的外泌体提取方法,使用超离法提取外泌体,获取更高纯度的外泌体,以减少杂质对应用结果的干扰。

外泌体是如何获得的

2、密度梯度离心法:密度梯度离心法是在差速离心法的基础上,根据囊泡与其他生物分子密度和大小的差异,加入分离介质如蔗糖和碘克沙醇等,使其在溶液中停留在不同梯度层,从蛋白质聚集体和非膜性颗粒中分离外泌体。

该方法分离纯度高,并且分离介质的缓冲作用还可以减少离心力对外泌体的破坏,适用于进行外泌体的功能学研究、标志物检测以及内容物的分析,使用该方法已经成功从细胞培养上清、组织等样本中分离出外泌体。但该方法操作更加复杂,限制了其分离效率及在临床和诊断研究中的应用。

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二、超滤法

超滤:外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体,可以使用多孔膜短时间低速离心对样本进行选择性分离,从而获得外泌体。 分为压力超滤和离心超滤。此方法简单高效,但由于过滤膜的粘附,可能会损失外泌体,并且过滤时的压力和剪切力,可能会破坏外泌体膜结构的完整性。

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三、沉淀法

沉淀的基本原理是使用聚合物分子结合水分子,以此降低外泌体在培养基、尿液等液体中的溶解度,通常使用聚乙二醇(polyethylene glycols, PEGs)。沉淀法的最大便利在于不需要特定设备,就能获得较多量的外泌体,缺点在于杂质较多。

外泌体是如何获得的

四、免疫分离

这一类分离技术的理论基础是外泌体双层膜结构上表达有特征性蛋白(marker proteins),于是可以借助特定的抗体来捕获外泌体。它的优势包括基于抗原抗体识别的免疫机制,故纯度较高;同时根据不同的表面标记,可以区分不同的亚组,有助于进一步的机制研究。缺点在于样品制备困难、花费高,且产量较低。

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五、微流控

基于微流控的分离方法是兼顾外泌体物理属性和生物化学属性的新方法,主要步骤包括免疫亲和(immunoaffinity)、过筛(sieving)、多孔结构捕获外泌体(trapping),仅需少量样本即可。将微流控技术和前面的分离方法联用的话,可以提高产量和纯度,可惜技术门槛较高,有碍大规模使用

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六、磁珠免疫法

将针对目的抗原的抗体通过生物素-链霉亲和素连接到磁珠表面,然后将磁珠与样品共孵育,使外泌体特异性结合到磁珠上形成磁珠-外泌体复合物,再用蒸馏水或者PBS冲洗,最后用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脱获得外泌体。

该方法相对于ELISA的好处主要是,珠粒提供了更大的表面积来捕获外泌体,从而提高了分离效率。此外,使用磁珠时,样品起始体积没有上限,而基于微孔板的ELISA分析的最大样品体积为100μL,且ELISA洗脱杂质时容易造成孔间交叉污染。当将磁珠法与金标准外泌体分离方法进行比较时,磁珠法可分离出更纯净的外泌体,特异性高、速度更快,并且不需要昂贵的仪器。另外,与其他分离方法(如超速离心或超滤)相比,磁珠法不影响外泌体形态。但是采用磁珠法时,外泌体生物活性易受PH和盐浓度影响。

外泌体是如何获得的

本文对常见的几种外泌体分离方法进行了综述,并分析了每一种分离方法的优缺点、适用条件。

目前看来,这些方法的组合使用可能优于单一的外泌体分离方法。随着研究的深入以及科技的不断进步,越来越多的外泌体分离技术及其组合不断涌现,外泌体的更多生物学功能终将被发掘,最终实现外泌体研究服务于临床诊断和治疗的目标,也将使未来精准医学更加便捷。

发布者:木木夕,转转请注明出处:https://www.cells88.com/wmt/4548.html

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