条件培养基在皮肤抗衰老中的应用

皮肤衰老是生理性、不可避免的，其具体表现多种多样， 包括组织变得萎缩、脆弱，出现修复缺陷、免疫缺陷及易受感染。皮肤衰老受内在及外在等多种不同因素的影响，同时在 衰老局部留下多种印记。皮肤衰老所导致的一系列不良后果， 使得人们对抗衰老的需求越来越强烈。

衰老过程包括生理和功能退化，这种退化在生物体的一生中不断发展，由各种遗传和非遗传环境因素引起，最终， 体内平衡被破坏，对疾病的易感性增加。临床上，皮肤衰老表现为细纹和皱纹、弹性丧失、色素异常、表皮变薄和粗糙度增加。随着年龄的增长，干细胞功能受损，不再维持表皮组织稳态和修复受损组织，导致皮肤衰老。

本系列旨在科学的讲述极受关注的干细胞相关抗衰老的研究进展，其中主要描述应用较多的间充质干细胞、诱导多能干细胞及其衍生物（外泌体、条件培养基、细胞外囊泡）在皮肤抗衰老中的研究成果及作用机制。

衰老是人生命的必经历程，皮肤是生物体最大的器官，衰老最先表现为皮肤衰老，其主要特征是皮肤干燥粗 糙、弹性减弱、松弛、皱纹加深等。

随着生活水平的不断 提高，人们比以往更加注重皮肤及身体的保养，对美的追 求也越来越高，因此对于皮肤抗衰老方面的研究是顺应时 代发展并具有重要的意义。

皮肤老化是一个复杂、渐进的过程，涉及外在和内在因素，外源性老化是由于环境侵 害，包括紫外线辐射、烟雾和常见污染物，其中紫外线 辐射是外在老化的主要因素，也被称为光老化，而内源性老化即自然衰老，随着老龄化现象的增多，如何延缓衰 老也成为研究中的焦点。

成纤维细胞是皮肤真皮中的 主要细胞类型，负责调节细胞外基质、胶原蛋白产生和伤 口愈合。这些细胞在维持皮肤正常结构和功能中起重要作用。

间充质干细胞在组织修复再生过程中发挥的有益作用包括刺激血管生成、抗细胞凋亡、免疫调节和抗炎作用等，大多数通过旁分泌细胞因子及外泌体等来发挥其治疗效力。

条件培养基与上清液

基质细胞分泌的分子是指基质细胞分泌组，包括蛋白质、microRNA、生长因子、抗氧化剂、蛋白酶体和外泌体，组成分泌组的基质细胞培养基被称为条件培养基，是丰富的旁分泌因子资源。

MSCs 分泌的因子包括各种细胞因子、生长因子及趋化因子等，存在于培养 MSCs 的细胞培养液中，因此，该培养液也被称为间充质干细胞条件培养基(MSC-conditioned medium,MSC-CM)。

总之，条件培养基(conditioned medium)主要指的是将培养过细胞的培养基除细胞取其上清液，直接用于培养其他细胞或作为其他细胞培养基的添加成分的方法。

同单独应用干细胞相比，MSC-CM 更易于制备、冻干、 包装和运输。此外，MSC-CM 内没有细胞成分，无需匹配供体和受体，可以避免免疫排斥反应及 伦理等问题。因此, MSC-CM 作为再生医学的药物具有广阔的应用前景。

值得注意的是，研究发现人诱导性多能干细胞产生的细胞外囊泡是间充质干细胞的16 倍。

MSC-CM 的成分 

MSC-CM 中富含各种分泌因子,主 要包括生长因子、抗/促炎细胞因子及各种其它细胞因子。生长因子包括血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF2)、血小板源性生长因子、胰岛素生长因子(insulin growth factor,IGF)-1/-2、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑 源 性 神 经 营 养 因 子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)等;抗炎细胞因子包括转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)、白 细 胞 介 素 (interleukin,IL )-6、 IL-1 0、IL-1 3、IL-1 7 及 IL-2 7;促 炎 细 胞 因 子 包 括 IL-8、IL-9 及 IL-1β;此外,MSC-CM 中也存在粒细胞集落刺激因子、前 列腺素 E2、神经营养素(neurotrophin,NT)、单核细胞趋化 蛋白-1 等。不同干细胞来源的 MSC-CM 内富含的活性因 子成分有所不同,不同的活性因子决定了 MSC-CM 具备不 同的作用及功能。

不同来源的 MSC-CM 中主要活性成分及功能

促进各种组织器官的再生和修复

华中科技大学同济医学院附属同济医院整形外科在 Front Cell Dev Biol.科技期刊上（下图）发表的研究指出，间充质干细胞条件培养基也含有间充质干细胞分泌的关键细胞因子和生长因子，可促进各种组织器官的再生和修复，起到抗氧化、抗皱和美白的作用。

同时，该研究指出脂肪源干细胞（ASCs）是一种从脂肪组织中分离出来的重要干细胞类型，具有多线分化、易于获得、高增殖潜力和自我更新的特性。

外泌体是细胞间交流的新前沿，调节着细胞的生物行为，如血管生成、免疫调节、增殖和迁移。

ASC衍生的外泌体（ASC-exos）是ASCs旁分泌的重要成分，具有多种生物活性。组织再生需要多种生长因子、蛋白酶、祖细胞和产生炎症细胞因子的免疫细胞的协调 "重要网络"。

最近，作为细胞间的信使，ASC-exos受到了很多关注，因为它们是重要的旁分泌介质，有助于组织再生。ASC-exos通过包裹各种类型的生物活性物质而具有独特的特性，在组织再生中具有巨大的应用潜力，通过修复细胞的迁移和增殖，促进血管新生，以及在不同组织中的其他特定功能。

在此，研究人员阐明了ASC-exos在整形美容外科组织再生方面的研究进展，包括皮肤抗衰老治疗、皮炎改善、伤口愈合、疤痕去除、皮瓣移植、骨组织修复和再生、肥胖预防、脂肪移植、乳腺癌和乳房重建。ASC-exos的生物学特性将为探索整形美容外科中组织再生的新型治疗策略提供进一步的见解。

各类细胞条件培养基

预防皮肤外源性衰老损伤

韩国首尔CHA干细胞研究所的研究指出，制备良好的间充质干细胞条件培养基在一定程度上起到了预防皮肤成纤维细胞内源性和外源性衰老损伤的积极作用。脂肪间充质干细胞条件培养基中存在的旁分泌因子( 表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子) 促进皮肤成纤维细胞增殖、迁移，增加细胞外基质、胶原蛋白的产生，从而改善皮肤弹性丧失等面部衰老体征。相关研究 Expert Opin Biol Ther.上（下图）。

将ASCs和ASC-CM应用于皮肤科显示出皮肤再生的良好效果。

保护皮肤免受氧化应激

韩国首尔Kangnam-Gu干细胞研究所的研究发现，间充质干细胞条件培养基已被证明可在体外保护皮肤成纤维细胞免受氧化应激。相关研究发表在 J Dermatol Sci  . 上。

该研究通过收获ADSCs的条件培养基（ADSC-CM）并测试其抗氧化作用。ADSC-CM的抗氧化作用与100microM抗坏血酸一样强，通过蛋白质组分析在ADSC-CM中检测到各种抗氧化蛋白。

形态学变化和细胞存活率测试显示，用ADSC-CM培养有助于HDFs抵抗tbOOH诱导的自由基。

此外，经ADSC-CM处理的HDFs的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性增强，这证实了研究中的假设：ADSCs通过抗氧化作用保护HDFs。

在细胞周期分析中，ADSC-CM处理可以逆转tbOOH诱导的细胞凋亡，并使亚G1细胞比未处理的细胞减少。ADSC-CM的抗凋亡作用也通过caspase-3的活性检测得到了再现。

这些结果表明，ADSCs具有强大的抗氧化活性，通过减少凋亡细胞来保护HDFs免受氧化损伤。因此，ADSCs和ADSC-CM是控制和预防各种皮肤状况中自由基造成的皮肤损伤的良好候选者。

iPS细胞的条件培养基和外泌体治疗皮肤老化方面潜力

韩国江原国立大学的研究表明，来源于人诱导性多能干细胞（iPS细胞）的条件培养基和外泌体改善了由紫外线光老化和自然衰老诱导的人皮肤成纤维细胞的基因型和表型变化。 相关研究发表在Int J Mol Sci  . 上。

该研究指出，干细胞及其旁分泌因子已成为再生医学的一种资源。许多研究表明，成人干细胞分泌的旁分泌因子，如外泌体，对皮肤老化有好处。

然而，到目前为止，很少有报告表明使用来自人类多能干细胞的外泌体来治疗皮肤老化。

在这项研究中，研究人员从人类诱导多能干细胞（iPSCs）的条件培养基中收集了外泌体，并研究了其对老化的人类真皮成纤维细胞（HDFs）的影响。细胞增殖和存活率由MTT试验确定，细胞迁移能力由划痕伤口试验和转孔迁移试验显示。

为了诱导光老化和自然衰老，用UVB（315纳米）照射HDFs，并分别进行30次以上的培养。通过定量实时PCR（qPCR）评估某些mRNAs的表达水平。衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性被评估为自然衰老的标志物。

结果，研究发现来自人类iPSCs的外泌体（iPSCs-Exo）在正常条件下刺激了HDFs的增殖和迁移。用iPSCs-Exo预处理可以抑制UVB照射引起的HDFs的损伤和基质降解酶（MMP-1/3）的过度表达。

iPSCs-Exo还提高了光老化的HDFs中I型胶原蛋白的表达水平。此外，研究人员证明iPSCs-Exo明显降低了SA-β-Gal和MMP-1/3的表达水平，并恢复了衰老的HDFs中I型胶原蛋白的表达。综上所述，这些结果表明iPSCs-Exo在治疗皮肤老化方面具有治疗巨大潜力。

此外，另有研究证明，将来源于诱导多能干细胞的高纯度细胞外囊泡应用于活性氧升高的衰老间充质干细胞时，细胞活性氧水平降低，衰老间充质干细胞的衰老表型减轻。值得注意的是，人诱导性多能干细胞产生的细胞外囊泡是间充质干细胞的16 倍。

条件培养基

条件培养基及微针治疗脱发

暨南大学附属第一医院整形外科的科研团队2021年在《感染、炎症、修复》上发表了综述报告指出，脱发是由多种毛发生长障碍引起的疾病，对患者心理有很大影响，超过50％的人有脱发困扰 。

其中，雄激素性脱发(androgenic alopecia,AGA)和斑秃是最常见的两种脱发类型。关于脱发的药物治疗。目前，美国食品药品监督管理局批准的AGA治疗方法包括口服非那雄胺和局部应用米诺地尔。

然而，药物治疗只是延缓脱发，并且有出现不良反应的可能。常用于斑秃的治疗方法为全身或局部应用激素或免疫抑制剂，治疗后患者常出现免疫抑制相关的不良反应。利用干细胞进行生物工程再生毛囊的研究为脱发的治疗提供了新的途径。例如，脂肪干细胞条件培养基(adipose derived stem cell-conditioned medium，ADSC-CM)没有细胞成分，无免疫原性，不需要进行供体-受体匹配，这使其成为一个更优的选择。

微针治疗作为一种微创的皮肤病学手术，在脱发治疗中的应用也逐渐增多，且微针治疗已经成功地与其他促进毛发生长的疗法例如米诺地尔、富血小板血浆和局部类固醇治疗等相结合，能够有效地刺激毛囊生长。

总结与展望

条件培养基是一种多生长因子的复合体，其所 具有的使用价值，是不同于以干细胞为代表的细胞医疗，也有异于单一外源性生长因子的应用。由于诱导多能干细胞、间充质干细胞等强大的旁分泌作用，含有大量多种生长因子的条件培养基的使 用价值被逐渐重视起来。 

条件培养基若想要在临床上得到广泛应用，首先则应规范条件培养基的提取程序与制度，确保条件培养基中所含各种成分对人体不具有潜在的安全性问题，比如动物血清对人体的影响等。此外， 在今后的研究中，对不同数量级干细胞提取的条件培养基各种生长因子的含量及所占比例是需要进一步确认的，且哪种干细抱是最适提取上清液浓度也是一个重要的问题；如今对条件培养基的储存及储存期限的研究并不明确，条件培养基在长期储存后是否仍具有良好的生物学功能， 这对将来条件培养基在临床上的推广使用也是一 个重要的前提与条件，而从条件培养基中提取外泌体可能是一个重要的方向；最后，对条件培养基中多生长因子间的相互作用也是亟需探索的，应从对单一生长因子的研究，逐渐发展到对多种生长因子之间 相互作用的探究。相信随着对条件培养基越来越深入的探究与了解，其具有的巨大临床使用价值将得到充分的挖掘。