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【细胞科普】关于CAR-T细胞概述

肿瘤是严重威胁人类健康和生命的主要疾病之一,每年全球罹患癌症的人数超过1400万,而死于癌症的人数超过800万。高发病率和高死亡率在一定程度上反映了临床上缺少有效防治手段的现状,这对肿瘤的预防和治疗提出了挑战。随着对肿瘤认识的不断深入,肿瘤治疗技术取得了很大的进步,显著改善了整体肿瘤治疗效果,但多或少存在副作用大、易产生耐药性等问题。目前,肿瘤生物免疫治疗已成为一种新的治疗手段。肿瘤免疫细胞疗法的出现让人们看到了解决这些问题的一丝曙光。
【细胞科普】关于CAR-T细胞概述

【细胞科普】关于CAR-T细胞概述

01

CAR-T的概念

CAR-T细胞是经过基因工程改造以表达靶向特定抗原的嵌合受体的T细胞。CAR-T细胞是经基因改造的T细胞,配备有嵌合抗原受体(CAR),它能使T细胞识别并消灭表达相应抗原的细胞。

简而言之,CAR-T即CAR与T细胞的组合。CAR全称Chimeric Antigen Receptor,即嵌合抗原受体,是与抗原识别结合域融合的T细胞受体(TCR的嵌合分子。尽管CAR-T 细胞具有天然的 TCR,但主要通过CAR受体识别其他细胞表面的特定抗原。因此,与TCR介导的识别不同,CAR 的抗原识别不依赖主要组织相容性复合物(MHC),因此可 以减轻T细胞受体(TCR)诱导免疫的局限性。

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CAR-T 细胞作用机制

02

CAR-T细胞疗法流程

自体CAR—T 细胞的制备首先须从患者外周血中取出T 细胞,通过离心去除粒细胞集 落刺激因子(GCSF),有研究表明粒细胞集落刺激因子可能干扰 T 细胞的增殖和表达。其次通过带有对 CAR 结构编码质粒的病毒载体传染等方式,最后体外扩增、纯化,检测 CAR-T 细胞的质量并灌输至患者体内。此外,在制备 CAR-T 细胞的同时,患者须接受 预处理化疗(即清淋),通常使用环磷酰胺或氟达拉滨等化疗药物减少机体对改造后的 CAR-T 细胞的排斥反应,以提高 CAR-T 细胞注入后的疗效

【细胞科普】关于CAR-T细胞概述

03

CARs的组成

从结构上看,CARs 主要由三部分功能区域组成,包括胞内结构域、跨膜结构域和 胞外结构域。

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1. 胞内结构域由共刺激结构域(Costimulatory Domain)和信号转导结构域(Signaling Domain)组成。共刺激结构域主要包括 CD28 受体家族(CD28)或肿瘤坏死因子受体家族(4-1BB、OX40、CD27)。共刺激结构域的主要功能为协同刺激分子和活化细胞内信号,使T细胞持续增殖并释放细胞因子,提高T细胞的抗肿瘤能力。如4-1BB  共刺激域可促进线粒体生成,增强T细胞的呼吸作用和脂肪酸氧化,抗原刺激后,CAR-T会优先分化为中央记忆T细胞。信号传导结构域通常为T细胞受体 TCR/CD3ζ,可发挥 T细胞信号转导功能。

2. 跨膜结构域将CAR的细胞外结构域和细胞内结构域连接,并将受体锚定于T细胞膜上,常用的跨膜结构域来源于CD4、CD8α、CD28和CD3ζ。

3. 胞外结构域主要由抗原识别结构域和铰链区构成。抗原识别结构域可识别肿瘤相关抗原(TAA),主要采用 scFv。单链抗体scFv(Single Chain Variable Fragment)是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过10-25个氨基酸组成的柔性短肽(linker)连接而成,是较小的重组抗体形式(约27kDa),不但保留了原始免疫球蛋白对抗原的特异性,而且增强了肿瘤穿透力。但目前CAR-T细胞常用的scFv源于小鼠,可能增加排斥反应或抑制物抗宿主病的风险。铰链区连接scFv和跨膜结构域,研究表明CAR-T细胞活化与铰链区长度有关,例如当抗原表位不可接近时,使用更长的铰链区可以使scFv克服空间位阻,有效结合抗原。

04

CAR-T细胞的分类

CARs 根据其胞内共刺激结构域可分为五代,但上市的 CAR-T 细胞疗法普遍为二 代 CAR-T:

第一代仅由胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域组成,但由于缺少共刺激信号的刺激,无杀伤功能或杀伤功能较弱,体内存活时间短;

第二代CAR-T具有1个独特的4-1BB或CD28或OX40分子共刺激结构域,增强了来自TCR-CD3复合物的“信号一,”T 细胞增殖能力和杀伤毒性提升。但研究发现CD28作为共刺激分子时,T细胞杀伤作用强但持续时间短;而4-1BB作为共刺激分子时,持续时间长但杀伤能力有限。目前临床普遍使用第二代CAR-T细胞,并已显示出较好的临床疗效。

目前,以4-1BB作为共刺激分子的CAR-T产品渐渐成为主流。2016年,Juno公司的JCAR015Ⅱ期临床试验因5名白血病患者在接受该疗法后出现神经毒性症状死亡而被美国FDA叫停。JCAR015的失败主要源于CD28共刺激域,CD28尽管可以快速刺激CAR-T细胞在体内扩增,但同时使CAR-T细胞快速耗竭,而且大量的扩增迅速提升了药物的风险,最终大大增加了药物的使用风险。

第三代CAR-T包含两个或更多个共刺激结构域的分子,有望进一步提升基因工程T淋巴细胞的活性和效力。但一些研究发现,第三代 CAR-T细胞的临床表现并未优于第二代CAR-T细胞,甚至劣于第二代CAR-T细胞;

第四代CAR-T在第二代的基础上增加表达特定的细胞因子(IL-12、IL-2 等),也称为“TRUCK”细胞,可在激活时分泌相应的细胞因子。IL-12是在局部肿瘤病变中吸引先天免疫细胞(巨噬细胞和 NK 细胞)的重要策略,第四代CAR-T细胞通过CRISPR技术 分泌IL-12可吸引NK细胞和巨噬细胞浸润到肿瘤部位,进一步增CAR-T细胞的有效性。

第五代CAR-T细胞通过敲除内源性T细胞受体(TCR)和白细胞抗原Ⅰ类分子(HLA),既降低异体移植时的免疫排斥反应,也避免了异体T细胞对宿主器官的免疫攻击(GvHD)。

CAR-T 细胞代数

CAR-T 修饰因子

                           特点

第一代

CD3ζ

体外T细胞激活,无常规T细胞杀伤毒性

第二代

CD3ζ+CD28/4-1BB/OX40

加入一个共刺激分子,体内存活时间延长,增殖能力、杀伤毒性提升

第三代

CD3ζ+CD28/4-1BB/OX40+CD28/4-1BB/OX40

加入2个或更多共刺激分子,增殖能力、杀伤毒性进一步提升

第四代

IL-12 基因

激活时分泌相应的细胞因子

第五代

敲除TCR和HLA,降低免疫排斥反应(异体 CAR-T 移植)

【细胞科普】关于CAR-T细胞概述

第一、二、三、四代CAR-T 细胞示意图

05

CAR-T疗法的优势

1、CAR-T细胞能够以非MHC限制性的方式识别和杀伤肿瘤细胞,不需要抗原 递呈,靶向性克服免疫逃逸,显著延长患者生存期;

2、CAR-T疗法注入的活细胞能够在患者体内增殖,与化学药物和生物制剂相比 , CAR-T细胞可以在患者体内维持长达数周或数月,减少了患者的用药频次,有望减少因剂量和给药频次导致的副作用,更好提升患者的治疗耐受性。

3、CAR-T疗法可通过与专门设计的CAR结构融合,适应多种肿瘤相关靶点,  更加精准地消灭拥有特定TAAs的癌细胞,避免杀死其他健康细胞。

4、CAR-T疗法一般仅须单次给药,传统的化疗或单克隆抗体药物需要经过多个治疗周期(一般为六至八个周期)长达数月的治疗。

 

06

CAR-T 疗法的劣势

1、在CAR-T疗法中,由于T 细胞在短期内大量被活化,细胞因子的释放短时间内呈爆发式增长,导致细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞活化综合征等严重不良反应。此外,神经毒性是CAR-T疗法的另一严重毒副作用,临床症状包括幻视、谵妄、言语障碍症等,临床上常使用托珠单抗(IL-6 受体抑制剂)或糖皮质激素予以治疗。

2、目前获批上市的CAR-T疗法局限于血液肿瘤的治疗,靶向B淋巴细胞上的特异性抗原(如 CD19 和 BCMA)。CAR-T疗法尚未覆盖实体瘤的关键原因在于相关肿瘤 靶点(TAAs)除了在肿瘤细胞表面表达外,在健康细胞表面同样表达,而靶向B淋巴细胞的CAR-T疗法一个常见的副作用是健康B细胞的清除,但由于CD19在大多数正常组织中不存在,仅在正常细胞表面存在,即使被清除后患者也可以通过终生注射丙种球蛋白提升免疫力,因此安全性较高。

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