嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法已经在某些血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了显著的成功，但是 CAR-T 疗法仍在多个方面存在大量挑战，包括优化 CAR 的结构设计、细胞产品、提高反应率、延长缓解的持久性、降低毒性和扩大这种治疗方式对其他癌症类型的效用等方面。
近年来，随着多组学技术的发展和相关数据的积累，包括基因组学、表观基因组学、转录组学、T 细胞受体谱分析、蛋白质组学、代谢组学和/或微生物组学在内的多维组学分析的数据，将为剖析 CAR-T 细胞复杂动态的多因子表型、过程和反应，以及发现新的肿瘤靶点和耐药途径提供了独特的机会。
在这篇综述中，作者总结了可用于促进我们对 CAR-T 细胞疗法的机制理解的多维细胞和分子分析技术。此外，本文还讨论了利用多组学数据来识别最佳靶抗原和其他分子特征的当前应用和潜在策略，这些特征可用于增强 CAR-T 细胞治疗的抗肿瘤活性和最小化其毒性。事实上，充分利用多组学数据将为 CAR-T 细胞治疗的生物学提供新的见解，有助于进一步加速研发具有更好疗效和安全性的产品，并使临床医生能够更好地预测和监测患者的反应。
👉 多维组学数据包括：基因组学、表观基因组学、转录组学、T 细胞受体图谱分析、蛋白质组学、代谢组学和微生物组学，这些手段及数据均已被用于促进我们对 CAR-T 细胞治疗的机制理解。
👉 利用来自肿瘤和非恶性组织的大量和/或单细胞水平的多组学数据是确定高效安全的 CAR-T 细胞治疗的最佳靶点的强大方法。
👉 整合大量和/或单细胞多维组学数据，已被用于研究 CAR-T 细胞持久性和抗肿瘤疗效的关键决定因素，包括 T 细胞状态和表型、肿瘤细胞特征、肿瘤微环境和微生物组。
👉 利用多组学数据有助于阐明 CAR-T 细胞相关毒性的机制，包括细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经毒性综合征和靶向、肿瘤外毒性等。
嵌合抗原受体 (CARs) 是一种人工合成的融合受体，旨在通过重定向 T 细胞的识别靶标以清除表达同源抗原的癌细胞。为此，CAR 通常使用靶向特定肿瘤相关抗原的抗体可变区，将其通过铰链和跨膜结构域连接到来自 T 细胞受体 (TCR) CD3ζ 链和共刺激受体 (如 CD28 和/或 4-1BB) 的细胞内信号基序。接着，编码这些结构的转基因载体被引入患者来源（自体）或健康供体来源 （异体）的 T 细胞。然后，将 CAR-T 细胞在体外进行大量扩展和筛选，并输注到患者体内抗击癌症。
▲ 图：CAR 的结构与 CAR-T 治疗过程 （10.1016/j.omtm.2019.11.018）
由于 CAR-T 细胞疗法在 B 细胞急性淋巴细胞白血病 (B-ALL)、大 B 细胞淋巴瘤 (LBCL)、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者中，都表现出令人印象深刻的有效率和持久性，并已成为复发和/或难治性 B 细胞恶性肿瘤的前线治疗手段。此外，CAR-T 细胞已被证明可诱导各种晚期实体肿瘤患者的临床反应，包括胶质母细胞瘤、胰腺导管腺癌、肉瘤、胃肠道癌和去势抵抗性前列腺癌。尽管与 B 细胞恶性肿瘤患者相比，CAR-T 细胞在实体肿瘤中的临床反应性较低且较短暂。然而，CAR-T 细胞治疗的临床成功面临着一系列挑战，包括在许多恶性肿瘤中缺乏稳定表达的肿瘤特异性抗原 CAR-T 细胞耗竭, CAR-T 细胞持久性有限和潜在的危及生命的毒性等。多组学数据，包括基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学等，可以深入了解各种组织或细胞中生物分子在多个维度上的丰度和/或变异。多维分析策略和整合方法的快速发展促进了多组学数据的使用，以描述广泛研究领域中不同细胞过程的复杂分子特征，包括 CAR-T 细胞治疗。CAR-T 疗法本质上是一种活细胞药物，其能够积极地感知和响应各种各样的外在和内在因素。因此，通过批量和单细胞分析，识别有害的表型异质性和制造前自体T细胞的通路调节可能有助于 CAR-T 细胞产品的质量控制，或为 CAR 设计或产品制造提供提高其功能的策略。此外，使用多组学策略来监测功能和/或功能失调的 CAR-T 细胞亚群的时间动态扩张，表征 CAR-T 细胞的转录组、表观基因组和代谢动力学，描述限制 CAR-T 细胞浸润和抑制 CAR-T 细胞毒性的肿瘤微环境 (TME) 特征，确定关键细胞因子的来源和功能，并预测新的靶标。此外，在非恶性组织中的非肿瘤毒性可以促进生物标志物的发现，并提高我们对 CAR-T 细胞治疗反应和毒性的机制理解。在这篇综述中，作者强调了多组学数据在推进改善 CAR-T 细胞治疗方面的潜力。本文首先概述了已用于 CAR-T 细胞治疗研究的多组学剖析技术。接下来，作者讨论了利用多组学数据发现单一和组合 CAR 靶标的策略。进一步地，作者讨论了通过多组学分析发现的与增强抗肿瘤反应和/或降低 CAR-T 细胞治疗毒性相关的分子特征和其他关键因素。利用当前和新兴的多维组学分析技术，我们将能够全面理解 CAR-T 细胞疗法的分子生物学，最终使这些治疗的临床效益最大化。一、多维剖析技术 (Multidimensional profiling technologies)来自基因组学、表观基因组学、转录组学、TCR 库分析、蛋白质组学、代谢组学和微生物学研究的数据已被用于解决 CAR-T 细胞治疗的剩余关键挑战。利用这些多组学数据可以为 TME 中影响 CAR-T 细胞治疗结果的肿瘤和非恶性细胞特征、细胞状态转变、细胞类型和细胞-细胞相互作用提供新的见解 (图1和表1)。
▲ 图1 | 多组学数据在 CAR-T 细胞治疗中的应用概述
▲ 表1 | 应用于研究 CAR-T 细胞治疗的代表性多组学分析方法
通过比较来自肿瘤和非恶性组织样本的 DNA 测序 (DNA-seq) 数据，人们已经确定了许多与肿瘤相关的体细胞突变。其中一些突变可能产生肿瘤特异性的新抗原，如果这些新抗原呈现在细胞表面，就可能作为 CAR-T 或 TCR-T 的新靶点。然而，迄今为止，用新抗原导向的 CAR-T 细胞靶向癌细胞的尝试还仅限于少数临床前和临床研究。另外，肿瘤相关突变和复杂的基因组改变，可能也会影响 CAR-T 细胞治疗的临床反应。通过全基因组文库化 CRISPR-Cas9 敲除筛选，随后通过测序检测单个 sgRNA 的频率富集情况，已使我们得以大规模、高通量研究和评估不同条件下单个基因的影响，从而更高效地确定细胞的功能依赖性。这种功能基因组学分析手段已经帮助我们确定了涉及 T 细胞激活、持久性、细胞毒性和功能障碍的关键基因，以及影响治疗耐药性的肿瘤细胞的遗传改变，提供了可能被利用来提高 CAR-T 治疗疗效的调控因子。同时，基于 CRISPR-Cas9 的功能获得性筛选结合单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq), 已被用于检测表达不同敲入结构的 T 细胞的丰度并评估其状态，该研究发现了一种可用于可提高 CAR-T 细胞对实体瘤清除效能的新型嵌合细胞共刺激受体。总之，功能基因组学分析是一种强有力的方法，可以阐明 CAR-T 细胞功能的机制调控，最终可能用于改进 CAR 设计或细胞工程。
表观遗传因素，包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质可及性和 3D 结构。复杂而多层次的表观修饰使多个细胞信号的整合能够动态调节基因表达程序，并最终调节 T 细胞的表型和功能。因此，通过扰动表观遗传调节剂对 CAR-T 细胞进行表观遗传重编程可能有助于提高 CAR-T 的抗肿瘤效能。全基因组表观基因组分析技术已成为研究表观遗传调控景观 (包括 CAR-T 细胞) 的最佳方法。例如，DNA 甲基化阵列分析可以帮助识别与 CAR-T 细胞治疗反应相关的差异甲基化位点。结合使用 ATAC-seq 和 RNA-seq 的转座酶可达染色质分析，可以促进识别表观基因组的调控模块，而这些模块控制与 CAR-T 细胞耗竭和细胞毒性相关的细胞程序，从而为潜在的表观遗传重编程策略提供了许多见解并有助于发现提高疗效的调控通路。
单细胞表观基因组学分析仍在快速发展，目前已经能够评估单个 CAR-T 细胞内的表观遗传调控图景。将单细胞 ATAC-seq 数据与转录组学和蛋白质组学数据相结合，有助于确定与 CAR-T 细胞功能亚群相关的表观遗传调控模式。总的来说，表观基因组分析研究的新证据证明了 CAR-T 细胞内动态表观遗传改变，及其在确定与治疗疗效相关的分子特征方面的重要性。
RNA-seq 对于我们理解细胞状态具有重要作用，并在肿瘤异质性和 TME 的表征方面取得了巨大进展。在 CAR-T 细胞治疗领域，RNA-seq 最常用于不同条件下的差异表达基因分析，以描绘与疗效相关的细胞状态转变。此外，监测编码各种细胞因子的基因转录的变化，这些细胞因子是 CAR-T 细胞活性的关键介质，对于提高疗效和降低细胞因子释放综合征 (CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS) 和其他毒性的风险也至关重要。总 RNA-seq 的应用提供了额外的信息，例如，非编码 RNA 的表达可以调节免疫调节分子，从而影响 CAR-T 细胞的细胞毒性。此外，转录后的 RNA 处理失调也可能产生不同的转录本，从而潜在地产生不同的蛋白质异构体，进而能够逃避 CAR 识别。因此，人们越来越重视利用现有的和不断增加的肿瘤 RNA-seq 数据，以发现源于 RNAs 的差异表达和调控异常的新型 CAR 靶点。
scRNA-seq 可生成单个细胞的转录组数据，自 2009年以来，scRNA-seq 已成为一种完善的方法并广泛应用于癌症研究。值得注意的是，scRNA-seq 是一种在临床前和转化研究中研究 CAR-T 细胞特征的新兴方法。例如，scRNA-seq 能够对 CAR-T 细胞输注产品进行基于基因表达的细胞状态检查。数据表明，细胞毒性、中央记忆、衰竭和其他细胞程序的特征可能受到 CAR-T 细胞条件或设计变化的影响，并与临床反应和毒性相关。除了 CAR-T 细胞产物的分析，将 scRNA-seq 应用于非恶性组织和肿瘤可以帮助识别罕见的细胞亚群，以阐明潜在的治疗相关毒性机制。此外，scRNA-seq 可以提供多种细胞类型的丰富基因表达数据。因此，scRNA-swq 已经成为探索 TME 中可能影响 CAR-T 细胞抗肿瘤活性的因素的最佳无偏倚方法。这些见解可能为克服 TME 的免疫抑制特征和寻求扩大 CAR-T 细胞在实体瘤中的应用提供潜在的新机会。
1.4 TCR 库分析（TCR-repertoire analysis）
TCR 是 T 细胞表面的一种异二聚体蛋白复合物，可由异质 TCRα 和 TCRβ 或 TCRγ 和 TCRδ 链组成，由单个 T 细胞克隆中不同的 V、D、L 和 C基因片段随机遗传重组形成。TCR 形成过程会导致不同的 T 细胞群具有高度多样化的 TCR 库，以介导抗原特异性的适应性免疫反应。高通量技术已经可以对每个 T 细胞中表达的 TCR 链进行测序，从而表征 TCR 库和 T 细胞群的克隆多样性。结合其他组学方法(如转录组学分析) 进行 TCR 测序，可以使特定的 TCR 克隆型与不同的 T 细胞表型相关联。这种联合分析可以通过追踪不同亚群间的 T 细胞克隆性来帮助描述 T 细胞动力学，而且这样的研究已经证明了高度扩增的 CAR-T 细胞克隆型在癌症患者中的细胞毒性和增殖特性。此外，单细胞技术的进步已经能够在单个细胞中同时进行 TCR 测序和 scRNA-seq，这将特定的 TCR 克隆型分配给具有不同转录表型的单个 T 细胞，因此可以将 TCR 克隆型用作整个治疗过程中 T 细胞功能状态扩张和持久性的替代品。需要注意的是，单个 TCR 克隆型可以包含沿着功能连续体的混合细胞状态，这些分析方法提供了进一步探索特定的克隆典型定义的T细胞状态是否与 CAR-T 细胞性能或毒性相关的途径。
蛋白质组学分析能够识别和量化蛋白质及其翻译后修饰 (如磷酸化和糖基化)，以表征细胞的通路活性和细胞功能。例如，免疫肿瘤学领域新兴的蛋白质组学分析方法极大地提高了我们对肿瘤免疫逃避机制的理解。值得注意的是，在癌症免疫治疗的背景下，应用单细胞蛋白质组学分析在 TME 中发现不同免疫细胞表型的临床相关性方面已经取得了前期的成功。
传统的蛋白质组分析技术，如提供选择蛋白质表达数据的蛋白质微阵列，已被应用于量化 CAR-T 细胞治疗后淋巴瘤或白血病患者的血浆细胞因子水平。而随着基于质谱的蛋白质组学技术的进步，人们已经实现了膜蛋白质组的高通量分析，包括细胞表面蛋白组和免疫肽组，以及磷蛋白组中反映的信号通路动态变化。肿瘤细胞的表面蛋白组已成为各种血液学和实体性恶性肿瘤治疗新靶点的重要来源。非恶性组织的免疫肽组和表面组可以作为肿瘤特异性靶点选择的参考数据库，从而避免靶上和肿瘤外毒性。磷酸蛋白组学可用于表征 CAR 下游信号活性，以评估与不同 CAR 结构相关的功能状态。因此，蛋白质组学分析加深了我们对 CAR-T 细胞治疗各个方面的知识，特别是 CAR 靶点的发现和 CAR 功能。
流式细胞术是用于免疫细胞分类的单细胞水平的膜蛋白和细胞内蛋白检测的金标准。全光谱流式细胞术的正在快速进步，其中高灵敏度的检测器阵列用于捕捉各种荧光分子的全发射光谱，通过增加可在实验运行中评估的细胞参数数量来提高通量，从而为免疫治疗研究中的蛋白质表达分析提供了一种强大的方法。大规模细胞术，或飞行时间细胞术(CyTOF)，结合流式细胞术和质谱技术，实现了高通量、单细胞蛋白质组学分析 (通过在一次运行中同时评估数百万个细胞中的>40蛋白)，用于实现多维度细胞表型的刻画。在临床前和临床环境中，CAR-T 细胞的蛋白表达的大规模细胞术分析，已被用于功能表征以帮助快速监测 CAR-T 细胞的动态特征。
单细胞分泌组分析技术也得到了发展。例如，单细胞微室、蛋白质组学条形码和多重免疫分析芯片已被用于通过预灌注 CAR-T 细胞产品量化约 32种选定效应物和免疫刺激分子的分泌，以衡量其“多功能性”，这些因子与临床反应和毒性相关。
代谢组学分析对代谢过程中产生的一组小分子进行表征，提供各种细胞代谢活动的功能解读。T 细胞的功能受内在和外在代谢因子的调节，而强大的内在代谢活性对于有效的 T 细胞毒性是必要的。例如，由于缺氧和/或营养可用性降低，TME 中的代谢中断可导致浸润的 T 细胞的代谢需求得不到满足，从而限制其抗肿瘤活性。因此，维持 CAR-T 细胞的代谢适应度对于提高其治疗效果非常重要，特别是增强其在实体瘤免疫抑制 TME 中的功能。
以质谱为基础的代谢组学能够同时进行靶向代谢物定量和全面的非靶向代谢物分析。一些研究已经描述了 T 细胞中通过各种生化过程产生的代谢物及其中间产物。糖酵解和三羧酸循环代谢产物的靶向量化强调了影响肿瘤浸润 T 细胞增殖和衰竭的固有代谢过程受损，提供了通过代谢重编程增强 CAR-T 细胞功效的机会。代谢组学数据还可以用于 CAR-T 细胞的代谢重编程，以增强它们的适应性和对不利的外部、微环境因素的抵抗力。
细胞代谢是可变的，能适应环境的限制。通量组学描述了参与细胞内代谢网络的代谢物的产生和消耗速率，这反映了细胞内的动态代谢过程。稳定同位素和质谱的组合可用于跟踪和量化动态代谢通量，称为代谢通量分析，从而能够对糖酵解和线粒体呼吸等感兴趣的代谢途径进行通量组学分析。这种方法对于不同 CAR 设计或不同环境条件下 CAR-T 细胞代谢过程的动态评估具有优势，新兴的通量组学数据表明，维持 CAR-T 细胞代谢适应度对有效治疗的关键作用。
微生物群正在成为调节癌症进展和治疗反应的关键因素。一些研究已经证明了肠道微生物组或饮食干预与免疫疗法的临床反应之间的相关性，特别是针对 CTLA4, PD-1 或 PD-L1 的免疫检查点抑制剂。此外，通过粪便微生物移植健康供体或应答者的有益菌群进行微生物干预，可以提高免疫检查点抑制剂的疗效。
两种主要方法已开发用于微生物区系的分析：16S 核糖体 RNA-seq (16S rRNA-seq)和宏基因组鸟枪测序。16S rRNA-seq 用于微生物分类组成的大规模分析更具成本效益，但不能提供关于病毒或真核成分的信息。宏基因组鸟枪测序全面覆盖了样本中存在的所有微生物，增加了发现在癌症中具有潜在作用的新物种的潜力，并为分析功能变异提供了基因水平分辨率的数据，尽管这些好处是以计算挑战为代价的。对接受 CAR-T 细胞治疗的患者的粪便样本进行微生物学分析，揭示了肠道菌群组成与治疗反应之间的相关性，这表明有希望利用与菌群的联系来改善 CAR-T 细胞治疗。目前的研究主要集中在肠道微生物群的影响上，然而肿瘤内微生物群也可能对抗肿瘤免疫反应有重要影响，这可能代表着未来需要探索的另一个维度。
二、将空间背景信息纳入组学分析（Incorporation of spatial contexture into omics profiling）
空间分子分析方法的进步，特别是空间转录组学和空间蛋白质组学，已经能够使用组织切片对基因和蛋白质表达的局部变异进行大规模和高分辨率的描述。空间转录组学是一项新兴技术，能够在近细胞或亚细胞分辨率下实现高维或转录组范围内的 RNA 定量，当与非空间分辨率的单细胞转录组学集成时，可以通过在组织结构中精确定位细胞来加强对细胞-细胞相互作用的分析。类似的方法正在开发用于空间表观基因组分析，如空间 ATAC-seq 和目标和标记下的空间切割 (CUT&Tag-seq)，这已被证明在高分辨率表征组织中的表观遗传调控方面具有实用价值。
已建立的空间蛋白质组学技术，如成像大规模细胞术，能够在组织载片上同时定量和定位大约 40 种蛋白质，同时保留组织结构，以解析 TME 的细胞组成，并在亚细胞分辨率探索各种癌症类型的细胞因子环境。此外，为了探索 TME 中 T 细胞代谢程序的空间组织，一项研究利用 CyTOF 来量化单个细胞中参与代谢调节组的蛋白质的表达，并将 CyTOF 与飞行时间多重离子束成像 (MIBI-TOF) 耦合以表征这些蛋白质在组织中的分布和表达。空间通量组学还可用于癌症研究的动态代谢分析。这些方法尚未应用于 CAR-T 细胞研究，但将空间背景纳入组学分析有望增加我们对细胞-细胞相互作用和细胞邻近如何影响与反应和毒性相关的关键细胞程序的理解。
尽管多组学分析在 CAR-T 细胞治疗领域有广泛的应用和显著的进展，但在数据分析和解释方面仍然存在显著的挑战。
首先，使用大块组织的多组学技术在大规模数据生成中具有广泛的用途，但在混合细胞群的背景下，信号的潜在掩蔽和信号的平均化可能会降低新靶点发现的潜力和结果的可重复性。这些问题可能可以通过新开发的反卷积算法得到解决，前提是潜在的参考签名准确地反映了相关微环境中每种细胞类型和病理状态的转录谱。此外，高分辨率单细胞和/或空间多组学分析技术的革命性应用为 CAR-T 细胞治疗提供了各种丰富的数据，尽管这些技术带来了一定程度的计算复杂性，需要开发和优化创新的生物信息学工具。
其次，适当调整分析方法以适应新的应用是实现生物解释稳健和可重复结果的一个具有挑战性但至关重要的步骤;对于大多数类型的组学数据，需要仔细评估和修正由样本处理协议和数据生成平台的差异引起的批量效应。此外，对于单细胞和空间组学数据，数据的稀疏性和背景噪声是共同的挑战，需要使用适当的计算算法进行信号检测。
第三，细胞中分子波动的动力学可能需要进一步的组学研究，并采用时间分辨率设计。事实上，一些研究已经证明了在 CAR-T 细胞治疗的不同阶段监测多组学变化的重要性，以更好地描述与治疗相关的生物学变化。
最后，随着多组学数据量的积累，迫切需要优化的计算方法来整合来自多个组学模式的数据。开创性研究已经证明了多组学机器学习模型预测治疗反应的能力，这表明人工智能算法有望在未来的研究中进行数据集成;然而，与复杂的分析程序和结果的生物学转译有关的挑战仍有待解决。
识别具有较高肿瘤特异性和覆盖率的 CAR 靶点，对于确保抗肿瘤疗效和降低 CAR-T 细胞治疗的毒性均至关重要。一般来说，理想的 CAR 靶点应该在所有肿瘤细胞的表面特异性地高表达，而不表达在非恶性细胞上。然而，由于肿瘤细胞和非恶性细胞之间共享大量抗原，以及肿瘤细胞之间的高度的异质性，确定合适的 CAR-T 细胞靶点一直具有极高的挑战性，特别是对于实体肿瘤而言。在这种情况下，利用和整合多维组学数据将是确定最佳的 CAR 靶标的一种极具前景的方法。
▲ 图2：多组学数据在 CAR 靶标识别中的应用
来自恶性组织和非恶性组织分析的转录组学和/或蛋白质组学数据已被广泛应用于发现肿瘤中过表达的 CAR-T 细胞靶标(图2)。在一项使用新型 RNA-seq 分析方法的研究中，glypican 2 被确定为在成神经细胞瘤细胞表面选择性高水平表达的靶标，而在非恶性组织中未被明显检测到。对人类蛋白质图谱和基因型-组织表达 (GTEx) 项目中包含的非恶性组织的数据，以及人类蛋白质图谱病理数据库和癌症差异表达蛋白数据库中包含的肿瘤样本的数据进行分析，其中包括 78种不同的组织、124种细胞类型和 20种癌症类型，揭示了超过 100个候选 CAR 靶点的表达图景。在另一项研究中，基因组学、转录组学和免疫肽组学数据被整合起来，以鉴定来自成神经细胞瘤中高表达的细胞内癌蛋白的 MHC 结合肽。由 PHOX2B 编码并由 HLA-A*24:02 呈现的非突变肽 (QYNPIRTTF) 被选为产生高度特异性的肽中心 CARs 的主要靶点，其在异种移植模型中诱导肿瘤的完全消退。因此，大量转录组学和/或蛋白质组学分析提供了大量和全面的公共资源，支持跨不同组织、细胞和癌症类型的 CAR 靶点的全基因组筛查。然而，平均来自大块组织的基因或蛋白质表达数据可能会掩盖来自罕见细胞群的信号，这对 CAR-T 细胞治疗的有效性和毒性具有潜在的重要意义。单细胞技术，如 scRNA-seq，能够以前所未有的分辨率进行组学分析，以发现 CAR 目标，包括识别潜在的安全信号。例如，对来自人类脑组织样本的三个独立的大规模 scRNA-seq 数据集的分析发现了一种罕见的表达 CD19 的壁细胞群体，这可能有助于 CD19 导向的 CAR-T 细胞治疗的靶向性、肿瘤外神经毒性。类似地，对两个广泛的 scRNA-seq 数据集的分析预测了 591个不同 CAR 靶点在广泛的组织和细胞类型中的靶向和肿瘤外毒性情况，确定了许多“潜在风险基因” (包括EGFR)。数据库 CARTSC 也可以作为提供单细胞水平的 CAR 靶表达数据的宝贵资源。新抗原是新型肿瘤特异性蛋白，主要由肿瘤细胞的体细胞突变产生，可能是免疫治疗的理想靶点。为了筛选新抗原，通常对配对的肿瘤和非恶性样本进行比较全外显子组或全基因组测序，以确定肿瘤特异性的非同义体细胞突变，然后进行 RNA 测序和质谱分析，以确认突变的 mRNA 和多肽的表达。几种新抗原已经被作为治疗血液系统或实体性恶性肿瘤的有前途的 CAR 靶点。例如，EGFR 变体III (EGFRvIII) 是一种在某些实体肿瘤中特异性表达的新抗原，包括胶质母细胞瘤的一个子集，导致正在进行的 EGFRvIII 定向 CAR-T 细胞的临床试验 (如NCT03726515, NCT03283631 和 NCT03638206)。迄今为止，高通量多维组学方法已经能够识别大量的新抗原，为 CAR-T 细胞治疗提供了丰富的肿瘤特异性靶点来源。事实证明，使用单一 CAR 靶点充分区分肿瘤细胞和非恶性细胞具有挑战性，这不仅是因为对靶点和肿瘤外的毒性，而且还因为抗原逃逸导致治疗耐药性。这个问题可以通过使用布尔逻辑门控 “AND”和/或“AND-NOT” 结合多个 CAR-T 靶点来进行克服，以增加肿瘤靶向的特异性并降低潜在毒性 (图2)。简而言之，只有当两个目标抗原同时表达在肿瘤细胞上时，具有 “AND” 逻辑门控的 CAR-T 细胞才能被触发；而具有 “AND-NOT” 逻辑门控的 CAR-T 细胞只有在存在肿瘤细胞上表达的靶抗原和不存在正常在非恶性细胞上表达的抗原时才能被激活。多组学数据集成已经证明了通过基于表达谱的组合 CAR 靶标的识别来改善 CAR-T 细胞设计的潜力。例如，对来自非恶性和恶性组织的大量转录组学和蛋白质组学数据集进行了综合分析，以提出急性髓系白血病的最佳CAR组合靶点，有四个可能的 “AND” 对满足严格的疗效和安全性标准。基于来自癌症基因组图谱 (TCGA) 中肿瘤和 GTEx 中非恶性组织的 mRNA 表达数据，对编码表面蛋白的 3567个基因进行了比较转录组学分析，确定了对 “AND” 和对 “AND-NOT” 门控 CAR 靶点。其他研究也类似地应用了多组学数据来发现“与”或“与-非”逻辑门 CARs 的双重目标。这种策略也可以应用于识别更复杂的 CAR 目标组合，如三重靶标。例如，来自 TCGA 的 33种肿瘤类型和来自 GTEx 的 34种非恶性组织的大规模 mRNA 表达数据已用于 2358个预测表面基因的综合计算筛选，以研究“AND”或“AND-NOT”逻辑门控制的 CARs 的两个或三个靶抗原的潜在组合。该研究表明，与单一目标相比，组合 CAR 目标具有更好的鉴别能力；所有预测抗原对的性能数据都可通过抗原探索者门户网站获得。尽管布尔逻辑门控 CAR 尚未在临床环境中使用，但其他减轻抗原逃逸可能性的组合抗原靶向策略，例如，在急性髓系白血病中预测 CLL1 和 CD33 的表达，在 B-ALL 和 LBCL 中预测 CD19 和 CD22，在多发性骨髓瘤中预测 BCMA 和 GPRC5D，在临床前和/或临床研究中显示出增强 CAR-T 细胞抗肿瘤活性的希望。单细胞表达数据也为预测 CAR-T 细胞组合靶标的有效性和安全性提供了高分辨率。例如，使用 scRNA-seq 数据的分析已经预测了基于批量表达数据识别的预定义 CAR 靶对列表的潜在毒性风险。理论上，需要充分利用来自肿瘤和非恶性组织的综合单细胞多组学数据来为 CAR-T 细胞治疗指定最佳靶抗原，从而限制毒性风险。一些 scRNA-seq 数据资源提供了包含多个器官和细胞类型的人类非恶性细胞图谱，以及正在开发的大规模泛癌症单细胞图谱(如人类肿瘤图谱网络所绘制的图谱)。然而，单细胞技术也有局限性，包括 scRNA-seq 测量值的很大一部分为零，这可能反映转录本缺失或基因表达的真正缺失。目前，发现既高效又安全的最佳 CAR-T 细胞靶点可能最好也是最可行的方法是，首先根据大量组学数据提名在肿瘤细胞中高度和普遍表达的有希望的靶点，然后使用单细胞组学数据预测指定靶点的靶上毒性和肿瘤外毒性的风险。值得注意的是，基于 RNA-seq 数据识别 CAR 靶标并不简单，需要与人体表面数据整合，并通过蛋白质组学技术(如流式细胞术)验证靶标表达。此外，靶蛋白在细胞表面的表达并不一定与临床反应相关，例如，由于肿瘤细胞中抗原的高度异质性表达，因此需要在严格的临床前研究和早期临床试验中对具有新靶点的 CAR-T 细胞产品进行仔细评估。四、了解并增强 CAR-T 细胞的功效和持久性（Understanding and enhancing CAR T cell efficacy and persistence）全面了解影响 CAR-T 细胞抗肿瘤疗效的生物学因素对于制定策略以实现稳健和持久的治疗反应并使临床获益最大化至关重要。整合大量和/或单细胞多维组学数据来研究与治疗疗效相关的关键特征的可行性已得到明确证明 CAR-T 细胞疗效和持久性的主要决定因素可以分为四大类：T 细胞状态和表型、肿瘤细胞特征、TME 和微生物群 (图3和表2)。
▲ 图3：与 CAR-T 细胞治疗疗效相关的分子特征的多维组学表征。
T 细胞群体的异质性在决定自体 CAR 产物随后的体内持久性方面起着至关重要的作用(图3a)。例如，一项对预制造 T 细胞群的整体批量和单细胞分析研究显示，较高比例的幼稚和早期记忆 T 细胞，特别是在 CD8+ 组分，与 B 细胞恶性肿瘤患者更长的 CAR-T 细胞持久性和更强的疗效相关。此外，效应 T 细胞中的 TCF7 (TCF1) 网络活性被发现与 CAR-T 细胞的长期持久性相关，而与 I型干扰素（IFN-I）反应相关的基因的上调，如 RSAD2、IRF7、MX1、ISG15、OASL 和 IFIT3，则与 CAR-T 细胞持久性较差相关。注入患者体内的 CAR-T 细胞产物的组成也是高度异质的，特定的 CAR-T 细胞群与有利或不利的反应相关 (图3a)。例如，在将 CAR-T 细胞输注到 41例晚期慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 患者前，对其进行了大量转录组学分析，结果显示，随后出现完全缓解(CR)的患者的 CAR-T 细胞富集于早期记忆程序和 IL-6-STAT3 通路基因的表达。相比之下，只有部分反应或无反应的患者的 CAR-T 细胞富集了与T细胞分化和衰竭、有氧糖酵解和凋亡相关的基因表达。CD8+ CAR-T 细胞亚群的特征是治疗效果的关键决定因素，特别是在抗肿瘤反应的初始阶段。在对复发性和/或难治性 LBCL 患者接受的 CAR-T 细胞输注产品的单细胞多维分析中，记忆性CD8+ CAR-T 细胞富集与 3个月的 CR 相关，而 CAR-T 细胞产品富集耗尽 CD8+ T 细胞和低水平 TCR 克隆型多样性与部分缓解或进展性疾病相关。CAR-T 细胞的组成也影响治疗持久性和/或长期疾病缓解。在一项涉及 12名 B-ALL 患者的研究中，结合 scRNA-seq 和 CD19 导向的 CAR-T 细胞输注产物转录组和表位的细胞索引测序 (CITE-seq) 表明，Th2 细胞功能的缺乏和效应相关表型的富集是 CD19+ 疾病复发的预测。此外，数据表明某些CD4+ CAR-T 细胞状态是 CD19 靶向 CAR-T 细胞治疗后长期缓解的主要要求。在一项纵向研究中，使用大量和单细胞多维组学数据来描述两名 CLL 患者中 CD19 导向的 CAR-T 细胞的功能和分子特征，这两名 CLL 患者的持续性 CRs 持续了 10年以上。具有细胞毒性、增殖和代谢活性表型的持续性CD4+ CAR-T 细胞克隆被认为是 CAR-T 长期持久性的关键决定因素。CAR-T 细胞的内在特征，包括特定基因的表达 (如关键转录因子)，表观遗传特征和代谢状态，与治疗效果相关 (图3a)。例如，单细胞转录组学和染色质可及性分析数据暗示转录因子 NR4A1, NR4A2 和 NR4A3 在 CAR-T 细胞功能障碍。此外，Nr4a 三敲除的 CAR-T 细胞的 ATAC-seq 显示，含有 NF-κB 和 AP1 转录因子结合基序的可达染色质区域富集。来自多维转录组学、表观基因组学和单细胞蛋白质组学研究的数据表明，转录因子 BATF 可以防止 CAR-T 细胞衰竭，并促进表型和转录谱向效应体样状态的转变196。在基因表达分析的另一种方法中，使用来自 114例用 CD19 靶向 CAR-T 细胞治疗的 B 细胞恶性肿瘤患者的 DNA 甲基化阵列数据，产生了一种称为 EPICART 的预测 DNA 甲基化标记。在初始发现队列 (n = 77) 和独立验证队列 (n = 35) 中，此特征阳性的预输注 CAR-T 细胞与更好的临床结果相关，并且富集了幼稚样或早期记忆 T 细胞表型。CAR-T 细胞的代谢状态可能会影响抗肿瘤活性和毒性(图3a)。基于 sgRNA 的 CRISPR 功能获得筛选平台已被开发并应用于原代 CD8+ T 细胞，结果鉴定了编码羟脯氨酸脱氢酶(一种参与脯氨酸代谢的酶)的 PRODH2 上调，作为增强 CAR-T 细胞功能的一种手段。PRODH2 敲入的 CAR-T 细胞的转录组学和代谢组学分析显示，这些细胞增强了代谢和免疫活性，并且在多个小鼠模型中提高了抗肿瘤活性。此外，CAR-T 细胞代谢活性可能导致失衡，并导致 ICANS，如低磷血症。将 CAR 转基因整合到基因组中可以影响关键基因，从而影响 CAR-T 细胞治疗的临床结果 (图3a)。例如，将 CAR 序列插入 CLL 患者的 T 细胞中会破坏 TET2 (编码参与表观遗传调控的甲基胞嘧啶双加氧酶) 的转录，并导致抗肿瘤反应增强。进一步的转录组学和表观基因组学分析显示，患者在第二个 TET2 等位基因中存在预先存在的低形态突变， TET2 中断的 CAR-T 细胞增加了效应分子的表达，如穿孔素和颗粒酶B，以及防止细胞最终耗尽的中央记忆状态。在一项对 40例 CLL 或 B-ALL 患者的 CAR 载体整合位点的高通量测序研究中，对治疗有反应的患者的整合位点富集了与介导T细胞增殖途径相关的基因，如磷脂酰肌醇、cAMP 或 TCR 信号通路或共价染色质修饰，这表明这些基因的插入突变可能导致更好的临床结果。CAR 结构的细胞内信号域也可以影响 CAR-T 细胞活性 (图3a)。在使用定量质谱同时检查 TCR 的 CD3ε、CD3δ、CD3γ 和 CD3ζ 信号亚基内的基于酪氨酸的免疫受体激活基序(ITAM)磷酸化的动态过程中，发现高水平的单磷酸化和 CD3ε 的基本富残基序列抑制TCR信号。值得注意的是，在 CD19-CD28−CD3ζ CAR 构建物中加入 CD3ε 衍生的 ITAM 碱基富残留序列区域，可产生与细胞因子释放水平降低、抗肿瘤反应增强和B细胞淋巴瘤小鼠异种移植模型持久性增加相关的 CAR-T 细胞产物。的确，不同的 CAR-T 产物有不同的表型和扩增特征。例如，Axicabtagene ciloleucel (Aaxis-cel) 和 Tisagenlecleucel 不仅在细胞内共刺激结构域 (CD28 与 4-1BB) 的来源上不同，而且在它们的铰链跨膜结构域 (CD28 与 CD8α) 和它们的整合载体 (γ转录病毒与慢病毒) 上也不同。在对输液液产品和在治疗前和治疗后不同时间点收集的 105个外周血单个核细胞样本的 scRNA-seq 分析中，19名接受 Axicel 治疗的患者和 13名接受 Tisagenlecleucel 治疗的患者，中枢记忆 CD8+ 细胞的扩增仅与 Tisagenlecleucel 的反应相关。对 Axis-cel 的应答者有更多的异质性 T 细胞亚群，而在 Axis-cel 输注产品中 CAR-表达调节性 T (Treg) 细胞的富集与缺乏应答相关。总之，这些发现强调了多组学数据在描述不同 CAR 设计和细胞产物之间差异方面的应用。肿瘤细胞的特征，包括抗原依赖和抗原不依赖机制，是对 CAR-T 细胞耐药的关键驱动因素。肿瘤中的抗原逃逸(即靶表位的丢失)是对 CAR-T 细胞产生抗原依赖性耐药性的主要原因，并已被证明通过下调、突变、选择性剪接、谱系转换或抗原掩盖而发生。DNA-seq 和 RNA-seq 分析发现，在 CD19 靶向 CAR-T 细胞治疗后，所有 12例复发 CD19阴性 B-ALL 的患者都有 CD19 外显子2-5的体细胞突变，这被认为是导致 CD19 截断和随后细胞表面表达缺失的原因。一项 RNA-seq 研究表明，CD19 的选择性剪接与外显子2跳过，导致细胞外 CD19 表位的丢失。相比之下，在复发的 B-ALL 患者中，scRNA-seq 显示 CD19 抗原通过错误剪接而丢失，导致 CD19 转录本保留内含子2无功能，并且该亚克隆在 CAR-T 细胞治疗之前就存在。一项流式细胞术研究报告了 4例 CD19导向 CAR-T 细胞治疗后 B-ALL 向 CD19- 髓系转移。结合小鼠模型的 RNA-seq 和 ChIP-seq 数据，进一步验证了髓系转换是在 CD19 靶向 CAR-T 细胞注入后触发的。此外，结合基因组学和转录组测序发现了一种新颖但罕见的与 CAR-T 细胞治疗耐药性相关的表位掩蔽机制：CAR基因意外地转导到单个白血病B细胞中，CD19 导向的 CAR 在该白血病克隆的子代上的表达阻止了 CAR-T 细胞的识别，从而通过与 CIS 中的白血病细胞上的 CD19 竞争性结合而对 CAR-T 细胞产生耐药性。这些结果表明 B-ALL 中抗原逃逸机制的复杂性。然而，尽管大约 28%的 LBCLs 在 CD19 定向 CAR-T 细胞治疗后复发时 CD19 表达降低，但未观察到突变和选择性剪接，其机制仍有待明确;因此，不同的恶性肿瘤可能存在不同的抗原逃逸机制。基因组学、转录组学和/或蛋白质组学分析的应用对于阐明不同背景下的抗原逃逸机制和制定规避抗原依赖耐药性的策略非常重要 (例如，通过设计双靶点 CAR-T 细胞产品) 。由肿瘤细胞对 CAR-T 细胞介导的细胞毒性机制的固有不敏感性引起的抗原非依赖性耐药也在很大程度上导致了治疗失败 (图3b)。新出现的证据表明，肿瘤细胞中功能失调的死亡受体信号可导致对 CAR-T 细胞毒性的抵抗。在全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选中，B-ALL 细胞系中参与促凋亡死亡受体信号传导的基因(包括 FADD、BID、CASP8 和 TNFRSF10B) 的破坏赋予了对 CD19 导向的 CAR-T 细胞的抗性，这通过诱导 CAR-T 细胞功能障碍(抗原持久性)进一步增强。相反，在白血病细胞中敲除抗凋亡基因(如CFLAR, TRAF2 和 BIRC2)会增加它们对 CAR-T 细胞介导的细胞毒性的敏感性。类似地，另一项 CRISPR-Cas9 筛选表明，肿瘤细胞上死亡受体 Fas 的表达对于抗原依赖的 CAR-T 细胞介导的杀伤以及旁观者T细胞介导的抗原阴性肿瘤细胞的杀伤至关重要。值得注意的是，DNA-seq 和 RNA-seq 数据表明，伴有 FAS 缺失的 LBCL 患者或 FAS 低表达患者在 CD19 导向的 CAR-T 细胞治疗后生存率较低。肿瘤细胞内的其他基因组学改变也与 CAR-T 治疗后的不良结果相关。来自 82例接受 CD19 靶向 CAR-T 细胞治疗的复发和/或难治性 LBCL 患者的治疗前肿瘤样本的整合靶向 DNA 测序表明，TP53 畸变 (突变和/或拷贝数损失) 与总生存期降低有关，但与无进展生存期无关。来自 562例患者的单独队列的大量转录组数据进一步表明，肿瘤中 TP53 的改变损害了干扰素信号、死亡受体信号和 CD8+ T 细胞浸润等过程，而这些过程对于 CAR-T 细胞介导的细胞毒性非常重要。在包括 LBCL 在内的多种情况下，TP53 的改变也与基因组复杂性的增加有关，并且在接受 CD19 导向 CAR-T 细胞治疗的 LBCL 患者中，基因组复杂性的高水平与不良预后相关。综上所述，这些研究强调多维组学数据的整合对于揭示 CAR-T 细胞治疗耐药的肿瘤内在机制至关重要。TME 通常含有多种免疫抑制细胞，包括 Treg 细胞、癌症相关成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞和骨髓来源的抑制细胞，以及可能限制 CAR-T 细胞浸润、增殖和效应功能的细胞因子 (如TGFβ、IL-10、IL-4 和 VEGF)，并最终导致 CAR-T 细胞衰竭。免疫抑制 TME 对 CAR-T 细胞治疗的挑战以及旨在克服它们的工程策略正在被广泛研究。虽然研究结果表明，肿瘤内髓细胞和细胞因子水平与 CD19 靶向 CAR-T 细胞的反应相关，但 CAR-T 细胞治疗患者的 TME 的询问仅限于靶向基因表达测定，尚未通过组学方法进行全面探索。在这里，本文将重点应用多维组学数据来深入了解恶性 TME，以促进新方法的开发，以增强 CAR-T 细胞的瘤内丰度、持久性和活性，从而提高其临床疗效 (图3c)。组学数据已被用于识别可用于增加 CAR-T 细胞渗入 TME 的关键调控因子。在乳腺癌小鼠模型中，干扰素基因刺激剂 (STING) 激动剂 DMXAA 极大地增强了 CAR-T 细胞在 TME 中的募集和持久性，scRNA-seq 揭示了趋化因子环境中的有利转变以及免疫刺激与免疫抑制骨髓细胞的平衡。在一项全基元筛选研究中，RNA-seq 揭示 PAK4 在胶质母细胞瘤来源的内皮细胞中具有调节间充质样转录激活的重要作用。在小鼠模型中，抑制 PAK4 激酶可改善 T 细胞的浸润，并使胶质母细胞瘤肿瘤对 EGFRvIII 导向的 CAR-T 细胞增敏。多组学分析也为识别 TME 中的关键免疫抑制因子提供了一种强大的方法，从而使 CAR-T 细胞能够抵抗这些因子。食道鳞状细胞癌的单细胞转录组分析表明，PD-L1 在 TME 的耐受性树突状细胞上上调，来自T细胞泛癌scRNA-seq图谱的数据表明，PD-L1 与 PD-1 的结合抑制 T 细胞的细胞毒性并促进免疫逃避，强调了 PD-L1-PD-1 轴作为 TME 免疫抑制的关键中介的已知作用。因此，通过将 CAR-T 细胞与抗 PD-(L)1 抗体、阻断 PD-1 的 CAR-T 细胞或表达 PD-1 显性阴性受体的 CAR-T 细胞或在 CAR-T 细胞中基因破坏 PD-1 表达，CAR-T 细胞对抗不良反应肿瘤的功效可能会增强。基于 TCGA 和 GTEx 的 RNA-seq 数据的泛癌分析显示，FASLG (编码Fas配体；FasL) 常在 TME 中过表达。因此，CAR-T 细胞协同工程表达显性阴性变体 Fas (FasL 的受体，通常在用于过继细胞治疗的自体 T 细胞上高表达)在各种实体和血液恶性肿瘤小鼠模型中具有更高的持久性和抗肿瘤功效。此外，CyTOF 分析表明，分泌 IL-18 的 CAR-T 细胞可以在不同的小鼠模型中调节 TME 并增强内源性免疫细胞的活性(例如，促进具有中央记忆表型的内源性 CD8+ T 细胞、具有 M1 表型的巨噬细胞和具有更成熟和活化表型的树突状细胞)，从而促进抗肿瘤免疫反应。综上所述，这些研究表明，利用多维组学数据可以极大地帮助克服 TME 中限制 CAR-T 细胞治疗实体瘤有效性的因素。微生物组正在成为影响 CAR-T 细胞治疗效果的关键因素 (图3d)。在一项涉及 48名接受 CD19 靶向 CAR-T 细胞治疗的 B 细胞淋巴瘤或白血病患者的前瞻性队列的多中心研究中，对基线粪便样本的 16S rRNA-seq 和宏基因组散枪测序显示，与没有癌症的个体相比，α-多样性水平显著降低，肠道微生物群的组成有本质上的不同。此外，在第 100天有 CR 的患者中，Lachnospiraceae, Ruminococcaceae 和 Bacteroidaceae 的特定细菌类群比没有CR的患者更丰富。黑色素瘤和胰腺癌小鼠模型的临床前数据表明，使用人类共生细菌 Megasphaera massiliensis 的代谢组学数据确定的两种微生物代谢物，即戊酸盐和丁酸盐，可以通过代谢和表观遗传重编程增加 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性。先前的知识，不仅肠道微生物群，而且肿瘤内微生物群可以对人类癌症产生多种影响，随着技术的发展，能够定量分析微生物群，将有助于进一步研究，以表征微生物群对 CAR-T 细胞治疗疗效的影响。CAR-T 细胞疗法的毒性可能是严重的，甚至是致命的，这对广泛的临床应用仍然是一个重大挑战。在杀死表达抗原的靶细胞的过程中，CAR-T 细胞通过分泌各种细胞因子和趋化因子诱导一系列炎症反应——这是一把双刃剑，可以放大抗肿瘤免疫反应，但也可能导致严重的毒性。最常见的 CAR-T 细胞诱导的不良事件包括 CRS、ICANS 和延长的细胞减少率。一些研究已经证明了多组学分析的潜力，以阐明这些毒性的机制，从而为潜在的预防和治疗策略提供信息。
▲ 图4：多组学数据揭示的主要 CAR-T 细胞诱导毒性相关因素汇总。
5.1 细胞因子释放综合征（CRS，Cytokine Release Storm)
CRS 由 CAR-T 细胞与靶细胞接触后产生的细胞因子，以及随后激活的内源性免疫细胞产生的细胞因子引起，这产生了一个免疫激活的正反馈循环，可引起严重的“细胞因子风暴”。在 CRS 的背景下，细胞因子水平和免疫细胞相互作用的特征对理解其病因至关重要 (图4a)。转录组学方法已用于确定介导这种过度细胞因子释放的关键免疫细胞类型和/或细胞相互作用。在 CAR-T 细胞诱导的CRS小鼠模型中，通过荧光激活细胞分选分离的髓系细胞的大量 RNA 序列显示，这些细胞，特别是巨噬细胞 IL-1 受体和 IL-6 表达的增加与 CRS 的严重程度相关。此外，来自高负担白血病人源化小鼠模型的CD45+白细胞的scRNA-seq分析表明， CAR-T 细胞输注后释放的 IL-6 和 IL-1 的主要来源是循环的人类单核细胞，时间过程分析表明，在 CRS 的发展过程中，IL-1 的产生早于 IL-6。此外，通过对 51例接受 CD19 指导的 CAR-T 细胞治疗的患者的血清样本进行蛋白质组学分析产生的细胞因子特征准确预测了严重 CRS 的可能性，这可能使早期干预成为可能。
5.2 免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS)
ICANS 是 CD19 导向的 CAR-T 细胞疗法的另一种主要毒性。靶向基因表达分析已经确定了高治疗前瘤内 Treg 细胞密度与降低 LBCL 患者 ICANS 风险之间的相关性，靶向单细胞细胞因子分析表明，输注产品中产生 IL-17a 的多功能 T 细胞频率较高与高级别 ICANS 风险增加相关。此外，针对 LBCL 患者的 CD19 导向 CAR-T 细胞输注产物的 scRNA-seq 显示，在高级别 ICANS 患者的输注产物中，有一小部分细胞具有单核细胞样转录特征。值得注意的是，这些细胞表达高水平的 IL-1β；这一发现，加上前面提到的 IL-1 信号通路在 CRS 和 ICANS 中的病理生理作用的独立支持，促进了IL-1受体拮抗剂预防 CRS 和 ICANS 的临床研究 (NCT04432506)。此外，来自人脑组织的scRNA-seq数据表明，CD19 在脑壁细胞上的表达也可能是 CD19 导向的 CAR-T 细胞的靶点。此外，对 45例接受 CD19 靶向 CAR-T 细胞的 B 细胞恶性肿瘤患者的粪便样本进行 16S rRNA-seq 和宏基因组鸟枪测序，证实 ICANS 与粪便微生物群组成之间存在关。ICANS 背后的机制是多因素的，仍然知之甚少;然而，利用多组学数据可以获得更清晰的理解 (图4b)。
5.3 在靶向/脱瘤毒性 (On-target/Off-Tumor Toxicity)
目前临床和/或临床试验中使用的大多数 CAR-T 细胞产品的靶点，在某种程度上都表达在部分非恶性细胞上。因此，CAR-T 细胞可以对非恶性组织造成损害，并导致靶向和肿瘤外毒性，特别是在靶向实体瘤时。在治疗期间，通过多组学分析来预测靶向性和肿瘤外毒性的风险，并监测患者的安全性，可能会更有效地管理这些不良反应38。通过结合大量转录组学和蛋白质组学数据，已经报道了包含 >100个单个 CAR 靶点和 >10万个逻辑门控靶点对的可靶向景观，且预测毒性最小。同样，对两个独立的大规模 scRNA-seq 数据集的研究在单细胞水平上定义了 591个CAR靶点和 320,884个逻辑门控“与”设计靶点对的安全格局。值得注意的是，通过利用 scRNA-seq 分析罕见的细胞群和/或类型，确定了几个潜在的危险靶点，这些靶点可能导致影响几个重要器官的毒性，包括 EGFR、PSMA 和 VEGFR2，这些在批量表达分析中未被确定为安全风险。总之，多组学分析可以大大拓宽对毒性的分子认识，从而促进减轻 CAR-T 细胞治疗不良反应的方法的发展 (图4c)。
CAR-T 细胞疗法已经改变了 B 细胞恶性肿瘤的治疗，但由于 CAR-T 细胞功能不佳和/或肿瘤细胞对这种疗法的耐药性，大量患者没有临床反应或疾病复发。此外，由于缺乏适当的 CAR-T 靶点、疾病复发的可能性和治疗相关的不良事件等一系列挑战，CAR-T 细胞疗法的适用性仍然有限。这些挑战的解决方案正在探索和开发中。不断扩大的多组学数据库可用于获得 CAR-T 细胞治疗的新分子见解。肿瘤和非恶性组织的多组学分析为大规模筛选 CAR 靶点和逻辑设计提供了可行的策略。与此同时，对 T 细胞、肿瘤细胞、 TME 和微生物群的表征可以破译决定治疗效果的分子特征和途径，以及与 CAR-T 细胞治疗相关的不同类型毒性的潜在机制和关键调节因子。目前 FDA 批准的 CAR-T 细胞产品是由自体T细胞制造的，这是由于避免移植物抗宿主病的优势，但此类产品存在与制造时间长和患者来源的T细胞功能适应性受损相关的缺点。值得注意的是，利用转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据对供体来源的异体 CAR-T 细胞产品进行多组学研究，并将其与自体产品进行比较，结果表明自体 CAR-T 细胞的代谢适应性受损，异体 CAR-T 细胞的激活水平更高，表明具有更大的抗肿瘤潜力。这些研究也促进了对异基因产物的机制理解，并描绘了“现货型” CAR-T 细胞充满希望的未来。
单细胞技术的进步极大地促进了 TME 中肿瘤和免疫细胞之间细胞表型和状态的显著多样性的探索，扩大了我们在免疫肿瘤学领域的集体知识。解释单细胞多组学数据的分析算法的并行改进，支持了单细胞技术的重要进展。进一步应用单细胞技术来研究 CAR-T 细胞治疗的各个方面可能会提供丰富和高分辨率的信息，为治疗策略提供临床相关的见解，以最大限度地实现持久缓解的潜力。此外，空间分析技术使原位细胞表征和空间保存的组织切片映射成为可能。虽然尚未用于研究 CAR-T 细胞治疗，但空间转录组学和蛋白质组学已用于研究免疫检查点抑制剂治疗背景下肿瘤细胞和浸润免疫细胞之间的相互作用，以探索细胞定位的临床相关性。单细胞和空间多组学技术的这些进展在解剖细胞成分及其细胞间连接方面显示出了前景，为克服有效治疗靶向障碍提供了机会，包括免疫逃避和 CAR-T 细胞的免疫抑制。
通过多组学数据集成利用有价值的多维资源，对于阐明治疗过程中细胞的进化和转变也具有重要意义。例如，结合 RNA-seq、CITE-seq 和单细胞 ATAC-seq 数据已被用于跟踪 CAR-T 细胞长期持久性的分子决定因素。此外，整合来自多个研究的组学数据可以获得更大的样本量，从而可能导致以前在样本量相对较小的研究中被低估的重要生物过程或特征的新发现。为此，需要进一步优化组学数据整合的计算框架，以便在 CAR-T 细胞治疗领域及未来的研究中充分利用多组学数据。
参考文献：Yang, J., Chen, Y., Jing, Y. et al. Advancing CAR T cell therapy through the use of multidimensional omics data. Nat Rev Clin Oncol (2023). https://doi.org/10.1038/s41571-023-00729-2
编辑：小果果，转载请注明出处：https://www.cells88.com/cells/myxb/26609.html
免责声明：本站所转载文章来源于其他平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。
说明：本站所发布的案例均摘录于文献，仅用于科普干细胞与再生医学相关知识，不作为医疗建议。
微信扫一扫 
支付宝扫一扫 