CAR-T 细胞疗法的制造和质量控制问题

嵌合抗原受体T细胞 (CAR-T) 疗法是一种新型癌症治疗方法，包括通过抗体样融合蛋白将体外扩增的T细胞重定向到肿瘤细胞表面表达的B细胞表位。表达CAR的转基因被整合到制造过程中患者或供体来源的 T 细胞的基因组；主要使用重组逆转录病毒载体，尽管非病毒方法也相关。药效学效应不受人类白细胞抗原 (HLA) 限制，并且不需要抗原呈递或内源性或疫苗启动的抗肿瘤 T 细胞所需的 T 细胞引发-细胞反应。CAR技术提供了一种机制，可用于免疫治疗破坏由于低突变负荷、免疫编辑或HLA分子突变作为免疫逃逸途径而导致内在 T 细胞免疫原性较差的肿瘤。

因此，这些新疗法可以用于治疗对免疫检查点抑制单克隆抗体 (mAb) 不敏感的肿瘤表型，并代表了快速扩展的免疫肿瘤治疗选择工具箱的重要武器。CAR-T应用代表了一系列疗法，这是开发时的一个重要考虑因素本文讨论的质量控制和安全策略。

分子生物学

CAR介导的肿瘤靶向通常是通过细胞外结合部分实现的；通常是单链可变片段 (scFv)，包含来自合适的小鼠单克隆抗体的轻链和重链的克隆可变区（图 1）。积累的数据表明，人源化或全人源 scFv 可能会降低抗药免疫原性的风险，从而在临床活性和安全性方面带来好处。

增强的结合亲和力也可以提高活性，尤其是对于低密度靶点，但风险增加了肿瘤外免疫病理学。一种灵活的蛋白质，通常包含源自CD8α 或免疫球蛋白 Fc 域的序列，将抗原结合部分连接到跨膜和细胞内信号域。由于 CAR-T 独立于抗原呈递细胞运作，并且可能在充满共抑制信号的肿瘤微环境中，最初的 CAR 方法仅依赖基于CD3ζ免疫受体酪氨酸的激活基序来激活目标连接后的 T 细胞，但在临床上表现不佳。后代，例如当今试验中的CAR-T疗法，使用CD28和/或4-1BB共刺激结构域来增强CD3ζ部分。细胞外靶向部分和细胞内信号传导成分的优化是应用研究的一个活跃且重要的领域。

图1 典型的CAR结构和细胞内信号结构域的演变。

临床前评估(推荐阅读参考文献34-41)

临床前阶段关口包括验证CAR-T特异性和效力；主要使用体外系统。基于动物的实验通常仅限于评估免疫功能低下小鼠模型中的CAR-T 功能。由于物种特异性，常规临床前PK和毒理学研究（为小分子疗法的首次人体评估提供信息和支持所需的类型）的用途有限。可以说，需要新的和改进的临床前模型来提供有关候选安全性和有效性的转化相关信息 。改进模型以了解和预测不良反应，例如细胞因子释放综合征 (CRS)，这是一种常见的临床并发症。 

背景与挑战

人们希望通过提高制造能力和降低商品成本来增加患者获得CAR-T 疗法的机会。开发针对实体瘤类型的新CAR-T疗法也是一个优先事项。良好生产规范（GMP ) CAR-T 疗法的合规制造比许多其他生物药物更具挑战性，主要是由于细胞成分的复杂性和可变性增加以及载体介导的基因工程步骤的重要性。αCD19 CART-T疗法的已发布信息表明高达10%的制造运行通常会失败。这是设置易于处理的产品规格的重要考虑因素，以确保质量并允许临床试验和制造过程优化中的可比性。最终产品质量与可测量的分子和细胞相关与临床活动相关的特征。因此，了解作用机制对于定义关键的产品质量属性（如效力）至关重要。如果没有这些信息，为制造过程和材料优化分配质量目标配置文件是具有挑战性的。阐明支持 αCD19 CAR-T 活性的机制原理一直很困难，因为多因素和潜在相关的产品和患者特异性因素可能是体内活性的原因。 

临床前模型存在缺陷，治疗的成本和有限的可用性进一步缩小了治疗范围。生成足够强大的临床生物标志物数据集来提供这些信息。欧洲监管机构最近发布了 ATMP 的 GMP 指南，其中专门解决了其中一些问题。指南文件概述了基于风险的评估方法，并传达了有关 ATMP 化学、制造和控制的某些要素所需的详细程度将增加通过开发阶段的产品进展逐步增加。尽管如此，监管复杂性和制造挑战代表了将实验室规模实验转化为关键临床试验和市场准备的可扩展过程的重要“能量驼峰”。

流程和优化

尽管存在一些复杂性，但每位患者的整体制造方案大致相似（图 2）；涉及 CAR 转基因离体插入，然后是大规模 T 细胞扩增和过程结束制定。辅助组件，例如细胞因子、培养基、病毒载体、抗体包被的磁珠，必须有分析证书并符合GMP验收标准。由于CAR-T产品制造的“及时”性质和潜在的狭窄机会窗口患者治疗、供应链中断都会产生很大的影响。提高良好生产规范 (GMP) 质量载体、细胞因子、抗体和其他关键试剂的供应链弹性和互操作性将有助于制造组织。提供合适的细胞系、检测、标准和参考材料来支持这一点现在被认为是我们公司和其他地方的一个重要目标。

细胞原料

大多数CAR-T制造方法利用通过白细胞去除术从患者身上提取的自体T细胞。循环肿瘤细胞数量增加，并用免疫调节药物进行大量预处理，导致不典型的循环免疫细胞特征和功能。单采产品可能含有足够浓度的这些元素，以影响制造过程。了解与制造成功或失败相关的细胞原材料概况是制造商的一个重要目标。在整个CAR-T制造过程中应用现代多色流式细胞术监测免疫细胞谱是一种策略。选择使用更通用和标准化的细胞起始材料有几个优点；具有显着降低制造成本、提高可重复性和扩大患者可及性的范围。

基因编辑技术的到来意味着同种异体来源可能会变得更加常规，因为这些技术可用于破坏甚至替代编码潜在同种异体抗原的基因。基因编辑方法还可以提高可重复性和效力。最近的一篇论文描述了将CAR靶向传递到 TRAC 基因座，从而将CAR表达置于内源性 T 细胞启动子的控制之下并消除 T 细胞受体的表达。这避免了强直性CAR信号传导并防止了T细胞耗竭，导致显着更高的持久性并在低得多的剂量下降低变异性。其他人已经消除了抑制性受体，例如程序性死亡 1 (PD-1)。基因编辑在适当应用于CAR-T疗法制造时可能会成为一项关键的使能技术。了解脱靶效应的潜力和影响现在应该是指导技术战略和监管的当务之急。生物信息学和全基因组测序是根本重要的工具，应该用于调查和控制；补充甚至替代动物研究。

实验性多能干细胞衍生的 T细胞底物的最新发展为该领域提供了另一种潜在的前进方向。尽管这一概念很有吸引力，但现阶段仍未完全解决对基因组不可预测性和相关致瘤性风险的担忧。了解与“安全”诱导的多能性相关的转录组学特征，结合改进的受控转基因插入方法，可能会推进“合成”T 细胞令人兴奋的可能性。然而，自体细胞来源的技术和安全挑战可能仍然存在CAR-T疗法的中流砥柱，至少在中短期内如此。

T 细胞选择和激活

提供安全有效的细胞疗法取决于了解和指定与目标产品概况相关的特定细胞群。T 细胞激活和扩增可以使用磁珠或涂有抗CD3和CD28 mAb的聚合物来实现，称为人工抗原呈递细胞。在介导有效 T 细胞扩增的同时，通过这些信号通路的长期刺激可以驱动分化并最终衰老：几项研究表明，分化程度较低的中央记忆（CD45RO+、CD62L+、CD95+）和干（CD45RA+、CD62L+、CD95+）记忆 T 细胞亚群在代谢特征、持久性和功效方面更胜一筹。在 CAR-T 制造过程中丰富或促进这些细胞群可能会改善患者的预后。最近的工作表明，在 T 细胞扩增阶段与IL-7和IL-15共培养可能有助于实现这一目标。

表达CAR的转基因的整合

γ-逆转录病毒载体是第一个用于CAR-T制造的转基因整合策略，并受益于高转导效率和易于获得且可扩展的包装策略。慢病毒载体的优势在于它们有效地转导非分裂细胞和分裂细胞，尽管规模生产具有挑战性但并非不可克服。问题主要与水泡性口炎G蛋白介导的细胞融合以及多质粒转染方法的产量限制有关。稳定包装细胞系的构建，例如 Sanber 等人描述的原型，可以提高慢病毒载体的制造能力。与 γ 逆转录病毒相比，慢病毒也可能因其较低的基因毒性潜力而受到青睐。现有证据表明，γ 逆转录病毒介导的整合有利于转录起始位点，而慢病毒没有显示出比其他位点增加的倾向。然而，这遗传毒性的理论风险仍然存在，并且被认为会随着每个细胞转基因插入数量的增加而放大。开发针对基因组安全港的载体和其他靶向整合方法将进一步降低风险。

符合GMP的病毒载体生产非常昂贵，目前生产能力不足。更便宜、更容易获得的替代基于病毒载体的转导将非常有益。基于转座子的技术，如睡美人，已成功用于 CAR-T 制造。转座是通过包含转座子和转座酶的基于质粒的载体的共电穿孔来完成的。转座酶与转座子编码的转基因两侧的反向末端重复序列结合，导致随机基因组整合。使用非病毒方法生产的CAR-T产品是否与病毒载体介导的转基因整合生产的产品一样安全和有效仍有待研究通过正在进行的临床研究的读数来证实。

运营管理

生物制药公司销售的CAR-T治疗产品最近获得批准反映了对复杂 ATMP 制造可扩展性的吸引力和乐观情绪。制造已经从主要由研究人员主导的利用通用设备和基础设施的制度化活动发展为更加自动化和封闭的系统基于设备的进程。

从本质上讲，存在两种操作“模型”，可用于未来具有成本效益的商业规模制造 (i) 流程方法，通常用于制造大规模生产的商品类型。在 CAR-T 疗法制造的背景下，患者的细胞进入一个合格的“生产线”，该“生产线”分为上述各种制造工艺步骤。每一步都需要定制的基础设施，需要训练有素的操作员，并且需要严格的线路清理协议来保证每个个性化产品的完整性。细胞扩增发生在数天到数周内，必须在工艺结束前在物理划分的单元中进行。这种模式适用于集中制造方法，细胞起始材料和最终的可能是冷冻保存的产品在不同的患者治疗中心之间来回运输。(ii) 以设备为中心。在这种设置中，专用设备或多或少地致力于制造患者的 CAR-T 产品。多个独立运行的设备可以放在一起，并由相对较少的劳动力进行监控，他们在系统出现故障时实施预先计划的补救措施。由于较低的人员配备水平和洁净室的严格性，这种方法很灵活，并且可能更具成本效益。它适用于更加分散的方法，可能在地理上与专门的患者治疗中心和专门的分析测试能力位于同一地点。无论采用何种操作模型系统，稳健可靠的数据管理和良好的分发实践对于确保患者特定组织和治疗产品的保管至关重要。 

过程控制和释放测试

生产转基因细胞疗法需要大量的过程中和质量控制测试。释放测试对于确认制造的医药产品的身份、纯度、安全性和效力至关重要（表 1）。质量控制测试对于自体CAR-T疗法尤其繁重，因为每个个性化产品“批次”都必须进行测试。及时性对于避免CAR-T 产品在输注或冷冻保存前降解至关重要。测试通常涉及复杂的分析，这些分析可能不适合自动化或高通量操作方式。

制造商强调缺乏合适的标准、参考材料和性能控制来确保测试的重现性和互操作性。在与临床疗效和安全性相关的分子和细胞特征方面仍然存在关键知识差距。当代多参数的应用和不可知的生物标志物策略，适用于免疫肿瘤学其他领域的类型，应该有助于识别与临床活动相关的更相关的关键质量属性。同样，随着长期临床安全经验的增加，有可能改进或编辑某些测试，例如遗传稳定性，但需获得监管部门的批准。 

安全

内毒素、支原体、多余的辅助成分和CD3阴性杂质的水平必须在严格定义的符合性限制内。微生物安全是CAR-T产品和一般细胞疗法的一个重要问题，因为制造过程与传统的肠胃外药物相比，它们的条件要少得多。确保源材料的无菌性可能存在问题，最终产品的灭菌不适用。常规的无菌测试方法可能对基于细胞的产品不太敏感；例如，样品的无菌性可能无法确保整个输液产品和标准无菌测试方案的无菌性，例如微生物生长培养基接种可能无法检测到所有潜在的污染物。原则上，极低的残留细菌负荷会在储存和运输过程中扩大。基于生长的微生物控制的新方法以及快速细菌检测的新方法是有必要的，并且EDQM已经开发了细胞治疗制剂的快速微生物测试指南。

目前的要求是检查主细胞库、生产终止细胞、载体浓缩物和离体转导的 T 细胞是否有复制病毒；尽管迄今为止没有证据表明第三代慢病毒构建体可以在任何测试的输注 T 细胞产品中获得复制能力。还需要有关每个基因组的整合载体拷贝、整合概况和整合位点的信息。工作包含具有明确载体拷贝数和插入位点的深度表征细胞系的WHO标准的制定和可用性将非常有利于确保制造质量，并有助于控制长期临床安全性研究。

纯度和鉴别

FACS分析是评估表型特征和CAR表达的当前选择方法，作为纯度和身份的衡量标准。现在，提供代表确定细胞表型的合适抗体和标准化制剂是提高细胞计数器和分析实验室测量标准化的优先事项。美国国家生物标准与控制研究所 (NIBSC) 的生物治疗学部已经生产了CE标记的荧光染料标记的T细胞亚群，并且正在开发类似的材料以支持跨生命科学的基于细胞仪的测量。

尽管对于常规表征非常有价值，但荧光激活细胞分选 (FACS) 分析仅限于基于先验知识和试剂可用性选择的相对少量参数。质谱流式细胞术和其他先进的多路复用技术是强大的工具，现在可用于识别可监测的其他表型标记，以改进制造和质量控制过程。

推而广之，大规模并行技术在这一领域具有实用性是合乎逻辑的。单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 是一项新兴技术，可用于对异质免疫细胞群中不同T细胞亚群的无偏分子表征。scRNA-seq可应用于CAR-T制造和作用机制为标准化提供信息的研究。具体而言，RNA-seq可用于识别与目标产品特征相关的转录组特征，即增殖、持久性、抗肿瘤效应子功能和安全性。

效力测试

根据cGMP指南，效力是用于确认批次间一致性、稳定性和质量的重要参数。评估通常涉及一种或多种生物测定，这些测定测量与产品作用机制内在相关的生物活性的某些方面。CD19 CAR-T疗法的效力测试主要是通过测量对靶标细胞系的细胞溶解活性来实现的或CAR-T与表达CD19的细胞系共同孵育后的IFN-γ分泌，即假定与体内抗肿瘤活性相关的短期效应子功能。然而，这种类型的生物测定给出了整个细胞系的平均读数。效应细胞群并且不考虑 T 细胞功能的全部潜在多样性。多重单细胞方法的可用性将极大地帮助细胞免疫疗法的输注前评估，这些现在正在出现。

基于短期效应器功能的读数与整体CAR-T效力的相关性也值得怀疑。Kunkele等人证明，在测量特异性裂解和细胞因子分泌的测定中产生最高活性的CAR-T构建体在体内表现出减弱的抗肿瘤效力。与此一致的是，越来越多的临床生物标志物数据表明，改善的结果与具有增强的扩增潜力 (Cmax) 和αCD19 CAR-T的输注有关输注后持久性 (AUC)。

免疫学法则以及表型和转录组分析数据支持以下论点：较少分化的中枢记忆（CD45RO+、CD62L+、CD95+）和多能干细胞（CD45RA+、CD62L+、CD95+）记忆 T 细胞亚群在这方面可能是最佳的。

Fraietta 等人研究了41名接受 Kymriah 治疗的慢性淋巴性白血病 (CLL) 患者的生物标志物。持久缓解与早期记忆 T 细胞的转录组学特征相关，而来自无反应患者的 T 细胞富含属于已知终末分化和衰竭途径的基因。因此，FACS显示CD8+ T细胞群中CD27+ CD45RO-细胞的频率与对该疗法的完全和持久反应显着相关。无反应者在注入的 CAR-T 细胞上具有更高水平的 T 细胞耗竭标志物，并降低了CD27表达。对输注的CD8 细胞上PD1和CD27表达的联合评估有助于准确预测临床反应，因此，可能代表 αCD19 CAR-T 产品质量控制的有用测量参数，增殖试验还可以增加细胞因子释放或杀伤评估。