JEV丨嵌合纳米复合材料用于快速分离尿液中的细胞外囊泡-干细胞&免疫细胞&外泌体&再生医学领域垂直媒体细胞世界

JEV丨嵌合纳米复合材料用于快速分离尿液中的细胞外囊泡

2022-03-02 11:50 • 外泌体应用 • 阅读 26659

癌细胞衍生的细胞外囊泡(EVs)是用于癌症诊断和预后的有前途的生物标志物。然而，从临床样本中难以获得足够高的EV产量、缺乏快速和灵敏的分离技术限制了它们的实用性。

来自韩国延世大学的研究人员制造了乳铁蛋白缀合的2,2-双（羟甲基）丙酸树状聚合物修饰的磁性纳米粒子(LF-bis-MPA-MNPs) 的嵌合纳米复合材料，用于从人尿液进行简单而灵敏的EV分离和前列腺癌检测。该研究发表于J Extracell Vesicles杂志上。

细胞外囊泡 (EVs)，包括外泌体（直径 30-150 nm，源自多泡内体的EVs）、微泡（直径 100-1000 nm，源自质膜出芽的EVs）和凋亡小体（直径1-4微米，源自凋亡的EV），由大多数类型的细胞释放。EVs包含DNA、信使RNA(mRNA)、microRNA (miRNA) 和细胞类型特异性蛋白，用作多种疾病（包括癌症）的生物标志物。体液中的外泌体作为早期疾病检测的非侵入性生物标志物发挥着特别重要的作用，可以用作无创或微创生物标志物。在体液中，尿液可以大量且频繁收集，比血清或血浆更简单和稳定，可用于检测前列腺癌 (PCa) 等疾病的生物标志物。

miRNA是长度约为18-25个核苷酸的小非编码RNA，通过削弱mRNA转录或促进其降解来下调 mRNA表达。外泌体miRNA，例如miR-21、miR-23a和miR-1246用于结直肠癌(CRC) 以及 miR-21、miR-155、miR-222和miR-29用于肝癌已被报道为临床诊断的潜在生物标志物。尽管EV可作为肿瘤标志物，但缺陷之一是缺乏快速准确的技术进行EV分离和分析的标准化。目前的分离方法，包括超速离心、基于尺寸的过滤、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀、基于免疫亲和性的技术、基于微流控的分离技术受限于耗时、需要纯化以在分析前去除杂质或需要笨重且昂贵的设备。此外，通常需要去除污染的蛋白质和RNA，并提出标准来提高基于外泌体的诊断的准确性。因此，应开发更有效的大样本分离/富集方法并将其应用于基于外泌体的临床检测。

纳米粒子(NPs)已被广泛应用。小尺寸、高表面积体积比、磁性和表面涂层后的稳定性使氧化铁 (Fe3O4) NPs 成为一个简单方便的分离方法。此外，许多类型的配体（如肽、抗体、叶酸等）可以与磁性纳米粒子（MNP）连接。各种具有表面涂层和固定配体的新型Fe3O4 NPs 已被制造用于即时检测。多种方法可用来合成MNP，例如共沉淀、微乳液、热分解、溶剂热法等。在这些方法中，共沉淀法是最广泛使用和最合适的MNP合成方法，可将颗粒尺寸控制在9 nm左右。

Fe3O4的缺点之一是由于其在空气中的氧化活性，这可能导致降解或磁性丧失。聚合物，例如葡聚糖、聚乙二醇（PEG）是用于涂覆MNP的化合物，具有多个官能团（如胺、羧基、硫醇、羟基等）的树状聚合物的高度分支化能够将MNP变的稳定和功能化。树状聚合物用于许多应用，例如治疗诊断学、生物传感器、光学、粘合剂和涂层。蛋白质的表面显示出许多阳离子基团，例如胺、咪唑、胍基。树状聚合物和2,2-双(羟甲基)丙酸 (bis-MPA)树状聚合物用于包被NPs，在 MNPs 的表面上进行修饰，MNPs是具有胺末端的树状聚合物发散生长的核心分子。表面上更多的官能羟基可以转化为硫醇官能团，并通过交联与乳铁蛋白（LF）的胺基结合。

LF是转铁蛋白家族的成员，是一种铁阳离子结合糖蛋白，分子量为77-80kDa。LF的生物学功能是抗微生物、抗菌、抗病毒、抗寄生虫和抗肿瘤活性。使用LF作为纳米载体具有许多优点，并且由于其物理特性，可用于EV分离。尽管LF的主要功能是其与游离铁结合的能力，但其也在生物靶标分离中有应用。LF的 N 端是阳离子和疏水的，在 8.0-8.5 的高pH值下显示出净正电荷，因此可以在较宽的pH范围内保持正电荷。与细胞的质膜类似，EV 带有净负表面电荷，主要来自磷脂酰丝氨酸（PS，一种带负电荷的脂质）可以与LF结合。除了PS，LF还与糖胺聚糖和硫酸软骨素蛋白聚糖相互作用。LF 与外泌体生物靶点结合另一个原因是 GAPDH的表达，充当了LF 受体。总之，静电、疏水和生物识别相互作用可能是LF与外泌体结合的关键因素。

在这项研究里，研究人员基于静电相互作用、物理吸收和生物识别相结合开发了LF共轭双 MPA树状聚合物涂层MNPs (LF-bis-MPA-MNPs) 的嵌合纳米复合材料，用于EV分离。LF-bis-MPA-MNPs分离EV的速度、效率、回收率和纯度优于使用已建立的方法。通过该方法，研究人员成功证明外泌体miRNAs在癌细胞衍生的外泌体显着高于非癌性外泌体的相对表达。最后，嵌合纳米复合材料用于评估来自 20 名前列腺癌患者、10名良性前列腺增生患者和10名健康对照者的尿液样本中的尿液外泌体miRNA。与健康对照组相比，两组均显着上调 miR-21和 miR-346、下调miR-23a 和 miR-122-5p。LF-bis-MPA-MNPs为临床应用中的人尿液外泌体分析提供了一种快速、简单和高产率的方法。

参考文献：Chimeric nanocomposites for the rapidand simple isolation of urinary extracellular vesicles. J Extracell Vesicles.2022 Feb;11(2):e12195.

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