JEV丨单个细胞外囊泡表面微区的三维成像-干细胞&免疫细胞&外泌体&再生医学领域垂直媒体细胞世界

JEV丨单个细胞外囊泡表面微区的三维成像

2022-03-09 15:37 • 外泌体应用 • 阅读 20336

细胞外囊泡由所有细胞类型分泌，并与组织稳态密切相关，可作为疫苗和基因治疗平台以及潜在生物标志物。由于它们的尺寸低于光学显微镜的衍射极限，生理条件下的直接可视化的这种纳米级的单个粒子具有阻碍。来自美国北卡罗来纳大学的研究人员开发了一种基于直接随机光学重建显微镜的单个细胞外囊泡的三维成像方法，并鉴定了表面相关标志物。该研究发表于J Extracell Vesicles杂志上。

外泌体是细胞外囊泡 (EV) 的一种。它们与其他较大的 EV 类型的区别在于它们的尺寸（通常直径约为 30-200 nm）以及它们的生物发生途径。外泌体源于细胞内部，从晚期内体向内出芽进入多泡体 (MVB)。内陷的内体富含转运所需的内体分选复合物 (ESCRT)、四次跨膜蛋白和脂筏相关蛋白。然后 MVB 运输到质膜释放出外泌体。许多外泌体蛋白质和特征与质膜衍生的脱落微泡是相似的。这些蛋白包括四次跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81。当然，一些研究认为各种EV在蛋白质组成和大小方面也具有异质性。

EV是进化上保守的细胞间通信网络的一部分，对于维持组织和机体稳态至关重要。EV 的内容物会因细胞状态而改变，在病毒感染和肿瘤发生时能观察到EV的一些变化。EV内容物向邻近或远处受体细胞的传递已被证明会影响细胞分化、转录、迁移、增殖、代谢状态和疾病进展。EV在细胞之间转移小代谢物、mRNA、miRNA、蛋白质甚至整个病毒。EV会因药物和人类疾病而改变。近年来，人们对EV作为小分子、RNA和蛋白质的传递剂、疾病的生物标志物和疫苗平台产生浓厚兴趣。然而，我们对EV的结构仍知之甚少。

生物学研究和药物应用取决于彻底表征和均质EV制剂。最重要的 EV 衡量标准是数量和规模。然而，EV太小而无法通过传统的光学显微镜观察到。这是该领域广泛认可的主要障碍。电子显微镜(EM) 代表了纳米粒子研究领域的标准，也已应用于EV。然而，许多 EM 制备方法采用脱水步骤，可能会改变任何液体囊泡的三维 (3-D) 形状。动态光散射、纳米粒子跟踪分析 (NTA) 和最近的纳米级流式细胞术等技术经常将EV分析结果作为单一的统计数据。这些方法在识别EV亚群方面可能受到限制，并且无法检测 EV 表面的标记聚类。这些方法中的大多数不如直接随机光学重建显微镜 (dSTORM) 敏感，并且可能会错过仅具有单个表面标记分子的EV种群。为了解决这一障碍，研究团队采用了多色 3-D 超分辨率显微镜来测量溶液中的单个EV并定位其表面的蛋白质。

开发了超分辨率显微镜可以用于可视化低于衍射极限（~ 250 nm）的物体。这包括多种技术模式。dSTORM依赖于对单个光开关事件的分析来绕过衍射极限。值得注意的是，dSTORM 不需要固定。EV 的分离以及测量是在生理条件（渗透压、pH、温度）下进行的。在这项研究里，研究人员在每个视野中以 3-D 形式对数百个单独的 EV 进行了可视化，对单个粒子进行了精确测量，基于四次跨膜蛋白标记（CD81 和 CD9）对亚群进行了定量，并在单个单个粒子的表面上定位了四次跨膜蛋白复合物。这些数据为EV表面存在微区提供了直接证据，并且Cryo-EM证实了这些微区的存在。这项研究中的单个粒子可视化提供了对 EV 的异质性、结构和复杂性的深入了解，而这些都是以前未被认识的。

参考文献：Imaging of surface microdomains on individual extracellular vesiclesin 3-D. J Extracell Vesicles. 2022 Mar;11(3):e12191.

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