本文主要内容是以CAR-T为例，介绍T、NK、DC、巨噬等免疫细胞 细胞治疗区别于化药、蛋白药，是指以细胞作为药物，利用自体或异体的成体细胞或干细胞对组织、器官进行修复的治疗方法。现在比较主要的细胞治疗包括了 干细胞 （脐带、脂肪等来源的间充质干细胞，胚胎干细胞或诱导多能干细胞iPSC来源的细胞）治疗和以T细胞，NK细胞，DC细胞，巨噬细胞等为代表的免 疫细胞 。其中以经基因工程改造的T细胞的CAR-T疗法为代表已经有多个产品在世界范围批准销售。 截止目前（2023年12月），加上上个月在中国刚刚获批的合源生物的纳基奥仑赛，全球已有7个抗CD19 CAR-T细胞商业化产品批准上市（美国4个，中国3个），另外还有3个抗BCMA CAR-T批准上市。 自体细胞疗法使得规模化、标准化的生产提出很大挑战，企业往往需要灵活工艺：全球获批的10款CAR-T细胞产品均为自体细胞疗法，治疗过程需要经过患者抽血、体外制备（激活、转染、扩增）、检验放行、冻干运输、回输患者体内等多个步骤。细胞药的特点是：CAR-T是患者自体免疫细胞单人的细胞治疗产品。不同于传统生物制品，CAR-T药物的生产工艺必须为每个病人单独制备。 CAR-T治疗程序涉及医院与工厂（生产）。在医院，医生采集患者血液样本，通过冷链或超冷链运输至制备中心。由于患者的T细胞较为脆弱，在运输过程中，运输时间长短和运输温度是影响PBMC（外周血单核细胞）的质量、活性、回收率的高风险因素，如果PBMC不达标将无法进入下一步制备。 在CAR-T细胞制备中心，GMP工厂接收供体的血袋，从PBMC中分离T细胞，激活分离出的T细胞，并通过病毒转导或电转导对其进行基因工程改造，以此表达CAR。将激活后的T细胞放置在专门细胞培养容器或仪器以及专门的培养基中扩增，使其达到一定数量，通常需要7-10天，然后将其冷冻保存，接着对冷冻保存的CAR-T细胞产品进行分析，最后将其运送到医院，解冻后输注到病人体内。这一制备过程非常复杂，其中T细胞分选效率、T细胞转导阳性率是制备出合格有效CAR-T细胞的CKI（关键指标）。由于转导后的T细胞更为脆弱且在GMP级别制备细胞不允许适用抗生素等，T细胞扩增培养与其他细胞相比难度更大。最后，将制备好的CAR-T细胞冻存运输回治疗中心也存在较高风险。 CAR-T流程概念图（来源网络） 免疫细胞涉及的生产工艺环节众多，以经典的CAR-T制备为例：可拆分为质粒、病毒、细胞的生产工艺三个相对独立的环节，其中: 1)质粒工艺流程:质粒是直接转染细胞或制备病毒载的重要原料。根据使用目的、所选用病毒载体的不同，质粒的生产要求也不同。如在慢病毒载体的构建中，需构建质粒共转293T细胞的三质粒或四质粒组装病毒系统。生产周期一般为7-10天。 2)病毒工艺流程:目的是生产病毒载体用以作为遗传物质递送系统。细胞与基因治疗领域常用的病毒载体包括逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒、慢病毒等。生产周期一般为2-3周。 3)细胞工艺流程:涉及细胞的培养、激活、转导、纯化、富集等步骤根据细胞的来源可分为自体疗法与异体疗法。生产周期一般为10-15天。 CAR-T生产工艺流程中还包含质控、质检、分析方法开发与验证等步骤。而在质粒、病毒、细胞生产流程的终点还需放行检测，合格才可成为商品化的CGT产品。上述三段工艺流程中，质粒和病毒的生产相对标准化，专业化外包能够降低生产成本、加快生产流程，而细胞治疗工程则需要利用自动化设备，企业前期投入成本较大。此外，根据FDA的规定，细胞治疗产品在申报IND时就必须确定生产工艺，此后若有重大变更须申报验证。因此，CAR-T产品工艺开发、放大与GMP规范下的规模化生产成为了较高的技术壁垒。 其中，细胞工艺流程技术路线分为开放式与封闭式，封闭式又分为全自动、半自动与隔离器手工操作。目前全球范围内半自动化与隔离器人工操作为较多采用的两种路线。半自动化设备以Cytiva、ThermoFisher等为代表，凯特、诺华、药明巨诺等多采用此路线；隔离器人工操作硬件门槛较低，花费不高，是很多对成本预算敏感公司的首选。 传统的细胞制备不需要高端复杂的设备，一般洁净区实验室有基本的细胞生物学设备都可以满足。但有一个重点需要注意，就是手工操作是在敞开式的环境中，所以需要在洁净区安放洁净台，而且用于生产的临床级细胞，要求符合GMP要求，因此通常需要B+A以上级别的洁净区。这对洁净区的硬件要求、管理、维护，对使用洁净区人员的耗材、培训，都会增加不小的负担。 随着行业的发展、现实的需求和技术的进步，各个厂商逐步开发了一些自动化的设备来满足工艺开发和生产的需要。这些设备分为全自动和半自动设备，其主要特点是： 1. 标准化， 大部分符合GMP生产要求以及21 CFR生产记录及质量控制要求； 2. 全 封闭， 在各个环节中全部在封闭容器中进行，各个环节间也用无菌管路对接，因此全程保证无菌，而且不再要求在B+A洁净区中操作，只需要在一般C级洁净区即可完成，降低了对操作场地硬件的要求，从而降低了运营建设成本； 3. 多使 用一次性耗材， 如管路、发酵罐、培养袋等，因此无需清洁验证，对生产的稳定性安全性提供了更好的保障； 4. 最大 程度减少人工操作， 避免不同人员不同批次操作的偏差，保证稳定性。同时可一人控制多台机器，大大提升效率的同时降低劳动成本； 全自动化设备主要有美天旎Miltenyi的CliniMACS Prodigy和龙沙Lonza的Cocoon两个系统。 CliniMACS Prodigy，一个人控制面板就能完成所有操作 1.Miltenyi的全自动化、封闭式、多功能细胞生产平台CliniMACS Prodigy，可驾驭复杂的临床级细胞制备，包括全自动完成分选、激活、转导、扩增、制剂、冻存等步骤。可应用于多种细胞的制备：如病毒转导/电转CAR-T细胞的制备；树突状细胞的富集和培养；造血干细胞的基因工程改造；移植工程（CD34富集，TCRα/β去除，CD45RA去除）；NK细胞富集、培养和编辑；病毒特异性T细胞的分选；贴壁细胞及其衍生物的制备；调节性T细胞的富集。 与CliniMACS Prodigy配套的主要试剂为磁珠、激活试剂、细胞因子、细胞培养基等；主要耗材为一次性管路、离心培养一体化Chamber、取样袋。 据美天旎统计数据，2021年时全球已有31个国家，超过50个细胞/基因治疗公司采购了CliniMACS Prodigy，全球有超过40个临床试验正在使用这台设备。 2.Lonza的Cocoon平台是一种功能封闭、自动化和可拓展的个性化疗法生产解决方案，可通过模块化设计，适用于悬浮细胞、贴壁细胞生产，包括T细胞在内的各类血细胞、免疫细胞，集成了磁珠分选、病毒转导或细胞转染、细胞活化、增殖、收获在内的多个步骤。Cocoon作为封闭式细胞生产平台，摒除以往昂贵的A+B环境，采用C级环境即可完成操作，能够满足CAR-T、TCR-T、TIL、MSC等工艺需求。Lonza的Cocoon®自动化生产增强了可控性以及可复制性，能够切实的满足产品从PD生产工艺到IND的过渡，并且符合GMP生产要求，只需平行放大，以此快速实现产业化的落地。
半自动路线在细胞疗法各生产环节分别由专用设备完成，是目前最主流的技术路线，设备以进口为主，国内厂商突破主要集中在扩增系统、冻存复苏及冷链。 血液分离系统，俗称“单采机”，是从献血者或病人身上抽取全血，添加抗凝剂，分离血液成分，采集单核细胞，去除特定成分，然后将未采集的成分回输给献血者或病人。在治疗性血浆置换和红细胞置换过程中不断回输适当的替换液。日本泰尔茂Terumo采血系统市占率30%左右。其中主要包括COBE Spectra系统和Spectra Optia系统等。 左：Spectra Optia；右：COBE Spectra 在CAR-T细胞产品的整个制备流程中，T细胞的分选和激活是最关键的工艺环节，直接影响到CAR-T细胞的抗肿瘤活性。进行T细胞分选可以带来如下好处： 终产品质量保证： 减小起始样本中单核粒细胞和B细胞的污染；批次间差异减小。 优化培养条件： 足够的T细胞百分比确保T细胞的后续扩增和激活。 减低成本： 在慢病毒转导前有更明确的细胞分群组成；避免病毒载体浪费，提高转导效果。 目前针对T细胞的分选及激活主要有2种策略。 一是以美天旎的Microbeads为代表纳米级别磁珠为基础的分选 ，主要策略包括有CD4/CD8的分选或CD3的分选，联合后续纳米级别的CD3/CD28抗体激活试剂；二是以赛默飞Thermo Fisher的Dynabeads为代表的微米级别磁珠直接偶联CD3/CD28抗体对T细胞进行分选及激活。 市场上纳米级别磁珠的大小在50-500nm之间，分为有柱式分选和无柱式分选。无柱式分选操作简单快捷，无需负担分选柱的耗材成本。无柱式分选由于纳米级别磁珠的磁力作用相对较弱，需要添加大量的磁珠抗体与细胞表面抗原结合，而过量的磁珠抗体标记可能对细胞的信号通路产生激活从而影响细胞功能，因此往往应用于阴性分选。另一方面，无柱式分选操作中存在开放操作步骤，如需应用到GMP生产，需要在A级环境进行操作。 有柱式分选，可通过分选柱结构有效增大磁场强度梯度，磁珠大小在50-100nm之间，少量的磁珠标记，细胞就可被分选出来，且无需对磁珠进行去除。借助于分选柱的密闭结构，可将整个磁珠分选的步骤在全密闭的自动化系统中完成，这也是目前CGT行业进行细胞分选的金标准之一。以美天旎CliniMACS Plus为代表的临床级别自动化设备广泛应用于细胞治疗领域。 国内厂家金斯瑞同样应用纳米分选磁珠和有柱式分选方案，自主研发的CytoSinct 1000细胞分选仪亦可以实现全封闭、安全高效、自动化的细胞分选流程，配合其自主开发的免疫磁珠，可以实现对包括T细胞、NK细胞、单核细胞、干细胞等多种细胞的富集和去除，可适用于多种细胞治疗产品的标准化生产。和美天旎相比，该产品还配备了审计追踪系统，符合21CFR Part 11要求，增加了工艺流程的合规性。另外，操作软件通过与自主研发的分选管路搭配，使得操作流程更加清晰、便捷。和其他国产设备相比，金斯瑞配套管路关键部位分选柱和GMP级的磁珠亦是自主研发生产的，具有相当的整体实力。 T细胞的另一种激活分选策略 则采用微米级别磁珠直接偶联CD3/CD28抗体，将分选和激活两步二合一。以赛默飞Dynabeads为代表的4.5μm级别的激活磁珠也是目前T细胞激活的另一主流产品。微米级别磁珠具有更强的结合能力，更强的激活效果。且微米级别磁珠无需分选柱结构即可完成分选，节省了分选柱的耗材成本。但监管法规要求对微米级别磁珠在最终产品的残留进行检测，并达到相应标准，因此需要对激活扩增后的细胞进行磁珠去除的操作。 CTS™ DynaMag™ Magnet磁力架可对Dynabeads结合的细胞进行分选，并对培养后的细胞进行磁珠去除。整个操作流程可在全密闭的管路及袋子中完成，但需要手动调整磁铁的角度，控制液流速度，从而达到最佳的分选或去除效果。 国内赛桥生物推出Gentle m-MACS自动化磁分设备，配套一次性密闭耗材，实现自动化微米级和纳米级磁珠分选及去除，软件设计符合21CFR part11的要求，全流程可追溯，弥补整个CAR-T制备工艺中磁珠分选的自动化及可追溯性工艺需求。 赛桥生物Gentle m-MACS微米磁珠全自动分离选择处理设备 T细胞活化对于CAR-T细胞转导效率至关重要。在体内是通过抗原呈递细胞（如树突细胞DC）刺激天然T细胞的增殖和分化。为了避免与DC共培养繁琐的过程，已经开发并实施了几种模拟T细胞天然刺激的方法。常见的方法是加入OKT3（抗CD3单克隆抗体mAb）和白细胞介素IL-2。目前临床上，激活T细胞的主要方法是用抗CD3/CD28抗体包被的顺磁珠激活。抗CD3/CD28 mAb和IL-2也占了1/3，其中包括了KITE Pharma的Yescarta。 利用基因工程技术，通过逆转录病毒和慢病毒载体、转座系统（如睡美人SB转座系统/PiggyBac转座子）或直接将mRNA转导到T细胞内，使T细胞表面表达嵌和抗原受体（CAR），即成为CAR-T细胞，拥有识别癌细胞和增殖的作用。其中，逆转录病毒和慢病毒载体是CAR-T细胞生产中最常用的基因转导方法，其他方法还有电转： 龙沙Lonza Nucleofector细胞核转染系统 结合电穿孔技术和细胞特异性转染液，将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中，并可直接入核，整合到细胞染色体中。新一代龙沙Lonza 4D-Nucleofector细胞核转染系统，市场占有率60%-70%，适用于不同类型细胞，包括传统上很难转染的原代细胞、多能干细胞、免疫细胞、神经元等；模块化设计，可单独配置不同功能模块/单元，兼顾了转染的灵活性和设备体积规模。 Lonza 4D-Nucleofector细胞核转染系统 赛默飞 Thermo Invitrogen Neon和Xenon电转染系统 CTS Xenon 大规模电转染系统，保持了与其小电转系统Neon一致的脉冲配置和开放的操作平台，通过简单的优化，满足大体积、符合GMP生产需求，为通用CAR-T、CAR-NK、TIL、TCR-T等创新疗法提供了非病毒生产的新选择。Gibco CTS Xenon电转染系统特点： 处理量大且快速：处理量为1–25mL，25min内能够转染多达2.5x10 ⁹ 个T细胞； 性能可靠，可保持高细胞活力：高达90%的基因敲除效率和80%的细胞活力； 非病毒性物理转染：可用于递送DNA、RNA和蛋白质； 封闭式系统处理工艺：MultiShot耗材可无菌焊接至PVC管或C-Flex管。 CTS Xenon Electroporation 系统 国内厂商苏州壹达自主研发的X-Porator M1 GMP级连续流式大规模电转染系统，专门用于细胞治疗工艺开发和生产，单次可电转100ml体积，单次处理细胞量达到了1010 ，具有稳定的转染效率。配合其自主研发的一次性USP Class VI医疗级耗材，PVC材质管路，通过6项第三方生物安全验证。软件亦符合 21 CFR要求，包含三级权限管理，符合GMP和FDA Master file要求。特别针对非病毒载体转导细胞、基因编辑细胞等的工艺与生产。与其小型电转仪H1具有良好的放大线性。
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