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间充质干细胞、免疫细胞、外泌体源头实验室

接上文

 

5. T细胞扩增

为获得临床应用所需的细胞数量的T细胞扩增可以有多种方法,包括T瓶,平板或培养袋以及生物反应器,例如G-Rex烧瓶(Wilson Wolf),WAVE波浪式生物反应器(Cytiva)。最近的统计表明,有43%的CAR-T细胞临床试验使用波浪式生物反应器,而使用静态培养袋的为35%,使用T瓶的为22%。

T型烧瓶不适合大规模工作,因为操作繁琐,并且需要在安全柜中进行多个开放式处理步骤。静态培养袋可以通过无菌管焊接在一起,并提供半封闭培养系统,但是培养基交换是手动过程,不易扩展。生物反应器具有几个优点:G-Rex烧瓶是具有优化的气体交换和采样选项的封闭系统圆柱形容器,可在培养箱中快速扩增细胞。

思拓凡Cytiva波浪式生物反应器Xuri W25

市场占有率达到90%左右。波浪式生物反应器采用非介入的波浪式摇动混合,避免了搅拌浆叶端和鼓泡对细胞的伤害,提供温和低剪切力高溶氧的细胞培养微环境。和静置培养袋相比,波浪式生物反应器培养体系最高可达25L,适应不同阶段或规模的细胞培养;灌流实现高密度细胞培养;内置的质量流量、气体混合和输出及在线监测DO和pH的功能允许自动灌注和气体交换从而减少了体力劳动和介质消耗。其中,Xuri W25细胞袋经过特别设计,更适用于免疫细胞,如T细胞的灌流培养。    

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Cytiva波浪式生物反应器    

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Wilson Wolf的G-Rex系统

悬浮细胞培养另一个重要的设备是G-Rex烧瓶,由Wilson Wolf设计和制造。G-Rex是一个圆底圆柱形烧瓶,底部有一个特殊的透气硅胶膜。容器中充满培养基,然后接种细胞。细胞在培养过程中沉淀,瓶下半部分密度高,上半部分密度低,并在膜上形成一厚层。这是一种高细胞密度培养方案,大的培养基体积提供了充足的营养物质,而硅胶膜确保了有效的气体交换,从而降低了缺氧的风险。细胞在烧瓶底部形成一层致密层,这使得在不干扰细胞的情况下很容易补充培养基。    

G-Rex系统的优势包括低介质消耗和与标准实验室设备(如层流柜和CO2培养箱)的兼容性,与传统培养袋相比,这显著降低了细胞培养操作的技术要求和成本,有助于实验室、临床前和临床环境中的放大。G-Rex容器也比T瓶更有效,更适合在符合GMP的条件下生产各种细胞产品。

G-Rex系统在与用于免疫治疗细胞产品制造的自动化GMP协议集成方面存在一些缺陷,特别是在细胞接种和质量控制阶段。这些问题主要是由于难以以密封和无菌的方式将大体积从烧瓶转移到其他设备,例如用于洗涤和缓冲液交换。此外,还包括取样和容器最大体积有限的问题。尽管有这些缺点,G-Rex仍然是扩大生物技术流程的最流行解决方案之一,并广泛用于免疫治疗制造。

总体而言,G-Rex烧瓶已被证明是一种经济高效的解决方案,显示出较高的细胞培养效率。    

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搅拌瓶和搅拌罐生物反应器

搅拌罐生物反应器更常用于在HEK293细胞中生产病毒载体,也可用于干细胞(需要微载体)和多能干细胞(PSC)的培养,但通常免疫细胞的扩增不采用此方案,因此不展开介绍。市场占有率比较高的品牌有荷兰艾贝泰Applikon,德国赛多利斯Sartorius的Ambr系列以及艾本德Eppendorf等。   

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Applikon ez-2 control和Eppendorf BioFlo 320

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Sartorius的Ambr 250和B-DCU       

 

6.细胞洗涤回收

临床使用的细胞用量往往达到每个病人107~109数量级,培养如此多数量的细胞一般需要数升体积的培养基。把细胞从如此大体积的培养基中回收并洗涤成为了另一个问题。传统手工操作的方法是离心,但是离心的体积很有限,而且操作十分繁琐(每次要低速离心30分钟,洗涤要洗涤三次),并且因为需要敞开式操作,也增加了污染的机率,不符合先进细胞生产的要求和理念。新鲜和冷冻起始材料的质量会影响最终产品。另外,细胞灌装之前还需要洗涤,比较成熟的方法主要是离心换液和半透膜。该步骤的目的是将培养基换成冻存液,对细胞进行洗涤,该工序要确保细胞状态尽量不受到伤害,回收率需达到要求。因此,连续细胞回收系统成为了一个非常有用的设备。    

Cytiva的 Sepax C-Pro和Sefia S2000系统

2017年上市GE Sepax C-Pro细胞处理系统区别于传统离心机,是基于Biosafe Group的轴向离心专利技术,用于处理细胞的一种自动化、功能性封闭技术的设备。    

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轴向离心机原理:在分离液中质量大的细胞在外围,活塞往上先顶出密度低的成分,再顶出密度高的成分。         

 

C-Pro市场占有率达到80%。主要特点有:自动化、封闭式,可处理体积范围一般为50~1200mL;终体积控制8-500mL±5ml;功能涵盖:①通过去血浆的方式浓缩单采血中的白细胞;②从单采血中去除血小板,从而浓缩白细胞;③密度梯度离心法富集单个核细胞;④细胞和磁珠孵育,并清洗;⑤病毒转导;⑥稀释、浓缩和洗涤细胞;⑦稀释和分装细胞产品到多个终产物袋中。    

Sefia S-2000细胞处理仪是Cytiva推出的大体积连续流细胞处理系统,SefiaS-2000细胞处理仪结合PremierCell Sefia协议软件和CT-300.1 Sefia细胞分离套件,可以从多达880ml的单采产品中分离细胞;若配合FlexCell Sefia软件和CT-800.1 Sefia细胞分离套件,则可以收获高达10L的扩增细胞。

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Sepax C-pro和Sefia S-2000

类似的其他厂家的同类产品还有

Thermo Fisher CTS™ Rotea™逆流离心系统;

CTS™ Rotea™能够与赛默飞其他设备像Xenon电转仪,摇摆式生物反应器Rocker等组合成CTS细胞生产平台,而且也能与市面上的其他工艺设备比如细胞工厂,G-Rex培养瓶实现工艺衔接。    

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CTS™ Rotea™逆流离心系统     

 

Millipore Sigma Ekko系统

Ekko是使用低能量超声技术进行过滤分离的封闭式细胞处理系统,其超声室设计通过重力、流体阻力和初级和次级声力的组合,使细胞聚集最大化,从而能够“捕获”如淋巴细胞这样的低密度细胞,因此更适用于处理高声学对比度(如微载体)和高细胞密度(如单采单元)的原料,可以直接进行灌注。    

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Fresenius Kabi Lovo系统

LOVO是一种通过旋转膜过滤技术清洗、浓缩和纯化白细胞的自动化细胞处理系统。该系统使用的是独特的微旋流技术,对细胞损伤低。该系统优势是最大可处理21L的原液体积,其源液去除率最高可达99.9999%。其细胞洗涤采用悬浮法,避免了离心法会导致的细胞堆积问题。该系统的高效换液使其能够快速去除血小板或其他小分子物质,减少纯化步骤。但不能分离红、白细胞,主要用于细胞洗涤;终产品有最小体积限制(>50mL)。    

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Lovo系统

Sartorius Ksep系统

赛多利斯的Ksep专利技术,该系统可以选择性地清除细小颗粒杂质,例如产生的塑料、细胞碎片、细胞外病毒等,在生产过程中进行分离。Ksep系列的封闭式细胞处理系统包括Ksep400和Ksep6000S。Ksep6000S有6个处理室,每个处理室的体积1L,能够连续处理高达6000L的体积。Ksep400可在2小时内完成50L多能干细胞的洗涤浓缩过程,细胞回收率达到90%以上,且对细胞活力没有负面影响。    

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Sartorius Ksep 400和Ksep 6000S

7.细胞冷冻保存

细胞制品无论是最终做成制剂还是建库经常需要冷冻保存。而细胞制品有别于其他生物制品,需要经过程序降温才能避免快速降温带来的过快生成冰晶对细胞膜的损害。科研级的冻存往往体积不大,细胞不多,用一般的程序降温盒(泡沫或内置异丙醇的塑料盒)就可以实现。但是临床用的细胞制剂因为体积大细胞多,临床级的细胞要求精确,因此需要专门的程序降温仪进行冻存。目前比较主流的程序降温仪有Thermo的CryoMed和法国卡苏CBS-Digitcool的程序降温仪。    

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Thermo CryoMed程序降温仪

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CBS Digitcool程序降温仪

8.细胞复苏

和冻存面临的问题一样,科研水平的细胞复苏往往用水浴锅,而制备级临床用细胞从冷冻状态下复苏亦需要专门的设备。目前比较主流的有Cytiva的VIA Thaw和Barkey干热式细胞复苏仪。    

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Cytiva VIA Thaw自动干热式复苏仪

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Barkey干热式细胞复苏仪         

9.细胞制剂灌装

细胞扩增、洗涤完毕后,不管是做成临床制剂,还是在生产、流通各个环节中需要冻存、建细胞库,都需要对细胞进行分装。传统隔离器中用移液管手工分装难以标准化,不精确,费时费力,敞开式操作容易污染,通量小,难以放大规模。如何在更高要求的生产过程中高通量快速分装,同时保证分装的精密度、细胞活率、细胞功能的完整性等?取代人工的灌装机应运而生,目前市面上有两类灌装机,一类仿制Terumo的FINIA,例如赛桥、中博瑞康等,通过挤压终产品袋实现细胞混匀并通过蠕动泵灌装;另一类通过万向摇动混匀器实现混匀,并经由蠕动泵灌装;两种方式各有优劣,但后者更易于放大且将低温混匀和灌装两部分做成模块化设计,满足不同阶段客户需求;真正做到了兼容自体和通用型细胞疗法的分装工艺。    

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Terumo FINIA

国内厂商苏州信号级联自主开发的Biobro Sep1采用的第二种方案,集合了4℃控温,混匀和精密灌装,可以在1小时内完成100个 250ml冻存袋的灌装(每袋灌装70-100ml),而且单次最大可以支持 7L 细胞终产物的处理,保证通用细胞产品的同批次生产。目前在国内已有多家IND联合申报案例。    

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BioBro Sep1         

10.无菌接管机

无菌接管机是一种在非无菌环境中将两根pvc管路结合,并保持连接件无菌条件的医疗器械。在细胞治疗的各个环节之间,因为需要在C级条件下进行全封闭无菌对接,因此接管机成为了一个必不可少的设备。目前市面上比较主要的型号有泰尔茂的TCSD II无菌接管机。国内厂商赛桥除了有台式设备PortWelder无菌接管机以外,还有更加方便的PortSealer手持式热合仪供选择。

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泰尔茂 TCSD II 无菌接管机

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PortWelder无菌接管机和PortSealer手持式热合仪

11. 质量控制中涉及到的设备

IPC/QC在生产中非常重要,常规检测包括pH值、无菌检测、支原体检测、内毒素鉴定、CAR基因拷贝数、慢病毒残留、细胞因子释放。

质量控制中主要涉及的设备有检测细胞用的流式细胞仪,目前流式细胞仪主流品牌一是美国BD公司,一是贝克曼公司,Thermo的Attune流式系统的实验室也较多。其他还有一些分子生化实验室常规的设备,如定量PCR仪,酶标仪等。本文不展开详述。

下表是对上文所述设备的汇总    

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五、自动化制备意义与未来

免疫细胞疗法作为CGT领域中走在最前列的先进医学疗法,相比传统药物,其生产制备具有很多特别之处:首先细胞是一种活物,其对培养、加工环境的敏感性更高,因此在制备过程中需要小心保护细胞的活力和状态,不能损坏细胞膜等细胞结构;其次目前的免疫细胞疗法以CAR-T为主,现在上市的产品都是自体产品,需要每个病人定制。加上质粒病毒制备等,生产成本特别高。如何降低细胞生产成本,其策略之一就是开发同种异体的细胞疗法。一旦需求上升,扩大产量,就可以摊薄单一制剂的制造成本;第三是细胞疗法作为一种新兴的疗法,目前其工艺生产开发还处于不断改进阶段,早期的手工操作会逐步转变为自动化操作。自动化的优势很多,上文已有描述:标准化;全封闭;一次性耗材,无需清洁验证;减少人工操作,稳定性高;全过程电子信息化。毫无疑问,自动化是细胞生产未来的趋势。    

目前CAR-T治疗最让人诟病的是其高昂的治疗费用和巨大的生产成本。降低成本亦是整个行业发展的方向。而采用昂贵的自动化设备到底是增加了成本还是能降低成本呢?以后我会撰文进行详细的核算。但是可以想见的是,一旦细胞生产规模化,其前期在设备上的大额投入,可以通过节省人员成本、节省洁净区成本和生产高效率来收回。目前各家主流公司已经在走这条路。譬如全自动生产设备Prodigy或Cocoon规模化的布局使用后,未来充满科技感的细胞治疗生产现场可能就如以下图片展示:

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人员在有限的场地中操作摆放整齐的CliniMACS Prodigy    
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摆满Cocoon的生产环境         

 

因此本文认为未来的细胞生产一定走的是现代化、自动化、无人化的路线。新工艺方案取代旧工艺方案这个趋势毋庸置疑。

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