针对实体瘤的 CAR-T 细胞临床试验的安全性和结果

大多数临床试验通过静脉注射 CAR-T 细胞（n=105；图 2）来应用 CAR-T 细胞，计数 T 细胞正确归巢到肿瘤。然而，也有其他可能的部位，特别是如果人们想将 CAR-T 细胞非常局部地应用于肿瘤或切除部位。例如，治疗脑肿瘤的试验使用颅内 (n=2)、腔内 (n=3) 或脑内 (n=6) 注射，或注入心室系统 (n=8)（图 2）。

19 项临床试验表明瘤内注射，9 项使用腹腔注射（图 2）。CAR-T细胞局部治疗肝癌或胰腺癌可以通过经导管动脉输注（TAI；n=3）、肝内动脉注射（n = 10）、胰动脉（n=1）或胰静脉（n=1）注射（图2）。共有 56 项临床试验未指明 CAR-T 细胞应用的部位（图 2）。

图2. 用于将 CAR-T 细胞应用于实体瘤的注射部位示意图。数字表示使用该注射部位的临床试验次数。

如上所述，在针对实体瘤的 CAR-T 细胞临床试验中，大多数靶向抗原并不完全具有肿瘤特异性。可能是抗原在正常健康组织上有一定程度的表达，并且由于意外杀死了共表达靶抗原的非恶性旁观细胞，CAR 可以诱导在靶上/肿瘤外毒性-T 细胞 [11]。为了能够在患者发现毒性后立即关闭 CAR-T 细胞，开发了多种策略（图 3）。

Rimiducid (AP1903) 和雷帕霉素是能够诱导含有诱导型半胱天冬酶 9 的构建体二聚化的分子，它们与 CAR 共同引入 T 细胞作为自杀开关。二聚化后，caspase 9 诱导 CAR-T 细胞凋亡，从而消除不需要的/意外的 T 细胞活性 。这种自杀开关用于 17 项临床试验（图 3），主要使用第四代安全 CAR-T 细胞（4SCART）进行。

有趣的是，rimiducid (AP1903) 还用于将基于 MyD88 和 CD40 (iMC) 的诱导型共刺激分子多聚化为 T 细胞，从而在体内选择性激活过继转移的 T 细胞，从而增强抗肿瘤作用实体瘤中的活性（图 3）。去除 rimiducid将再次关闭这种共刺激。

图 3. CAR-T 细胞治疗实体瘤的安全性测量示意图。数字表示使用此安全性测量的临床试验数量。

使用的最古老的自杀开关之一是单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦 (HSV-tk/GCV) 策略。从机制上讲，HSV-tk磷酸化 GCV，产生的三磷酸形式被 DNA 聚合酶整合到 DNA 中，导致链终止和细胞死亡。HSV-tk/GCV 也诱导细胞凋亡 。使用HSV-tk/GCV的一个缺点是它在免疫活性患者中可能具有免疫原性，导致 HSV-tk转导细胞的持久性有限。尽管如此，三项临床试验仍然使用HSV-tk/GCV 策略（图 3）。

此外，一些修剪过的分子用于选择和/或去除 CAR-T 细胞，如截短的 HER2 (HER2tG)、截短的 EGFR (tEGFR) 和截短的 CD19 (tCD19)（图 3）。曲妥珠单抗 (Herceptin®) 与 HER2tG 结合并在两项临床试验中用于通过补体或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 消除 CAR-T 细胞的靶向/脱瘤反应（图 10）。在八项临床试验（图 3）中，西妥昔单抗通过相同的机制用于消融表达 tEGFR 的 CAR-T 细胞。七项临床试验使用截短的 CD19 作为 CAR 阳性 T 细胞的选择标记，或使用与假单胞菌毒素 (CD19-ETA') 偶联的抗 CD19 抗体作为消除标记（图 3）。一项临床试验使用未公开的“终止开关”作为安全措施（图 3）。

避免由 CAR 的靶向/非肿瘤反应引起的长期自身免疫的特殊安全措施是通过 mRNA 电穿孔引入CAR（n=5, 2.6%）。我们之前已经证明，使用mRNA电穿孔用 CAR 瞬时转染 T 细胞可能是癌症免疫治疗中一种有效且安全的工具 。

电穿孔程序基于复杂的物理化学机制，在施加电场后导致质膜穿孔，从而允许 mRNA 随后进入细胞质。使用 RNA 转染的CAR-T细胞的优势在于受体表达受到时间限制（图 4），从而使潜在的脱靶和脱靶/脱肿瘤毒性也瞬间发生。CAR-RNA 转移策略在探索用于CAR-T细胞疗法的新肿瘤抗原的 0/1 期临床试验中特别有吸引力，但临床安全性未知。

图4.通过mRNA电穿孔引入 CAR 的示意图。表明引入的mRNA随着时间的推移稳定性低，并且CAR在T细胞表面上的瞬时表达。 

CARs mRNA 转染策略同时也被其他人应用于临床试验。在实体瘤患者中，c-MET 被用作乳腺癌和黑色素瘤的 CAR 靶抗原，（NCT01837602；NCT03060356）和间皮素用作间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的 CAR 靶抗原 , (NCT03608618; NCT01897415; NCT01355965)。

甚至使用 CD19 和 CD123 作为靶抗原对非实体瘤进行了 RNA 转染，（NCT02277522；NCT02624258；NCT02623582）。这些研究中的 mRNA-CAR-T 细胞耐受性良好，细胞迁移到原发和转移性肿瘤部位，显示出临床抗肿瘤活性，并且没有证据表明对正常组织。局部应用后，c-MET-CAR-T细胞诱导肿瘤内坏死。重要的是，一些注射的 c-MET-CAR-T 细胞进入血流，可以在循环中进行短时间监测。

Beatty等人发表的临床试验和 Maus 等人使用间皮素作为抗原，在完成第三次输注后的几分钟内，在一名间皮瘤患者中显示出细胞因子释放综合征 (CRS)，导致不良事件（过敏反应、心脏骤停、呼吸衰竭、弥散性静脉内凝血。

相比之下，在胰腺癌患者中，没有细胞因子释放综合征，也没有剂量限制性毒性，但在 6 名患者中有 2 名实际上病情稳定]。使用RNA-CAR-T细胞时，稳健的增殖和持久性并不那么重要，因此无需进行淋巴耗竭，因为瞬时受体表达本身就需要重复注射。与在clinicaltrials.gov注册的大多数试验使用病毒转导细胞不同，这些试验只需要应用一次，假设这些细胞会在肿瘤抗原识别后增殖，不需要重复应用，RNA转染的细胞将失去CAR表达（图 4) 并且必须从外部补充以维持对肿瘤的细胞溶解压力。

Maus等人在上述患者中描述的严重不良事件的可能原因。和比蒂等人， CAR 是基于鼠类抗体，不良事件是由 CAR 中的 scFv 特异的 IgE 抗体引起的（即人类抗小鼠抗体 (HAMA) 反应），随后导致 CRS额外注射CAR-T细胞。这些抗体可能是由 CAR-T 细胞的间歇给药方案诱导的。在第 0 天和第7天前两次注射 RNA CAR-T 细胞后，在第49天漫长的等待期后进行第三次注射。这足以完成从 IgG 到 IgE 的同种型转换。因此，如果诱导 HAMA 反应，快速重复输注似乎是防止同种型转换的最佳方法。

尽管如果 CAR-T 细胞诱导了靶向/非肿瘤反应，通过用 mRNA 电穿孔在 T 细胞的细胞表面上瞬时表达 CAR 可能是一个优势，但它也可能是适用性的劣势.必须仔细监测注入的 CAR-T 细胞是否在 CAR 表达过低而无法有效抗肿瘤反应之前及时到达其肿瘤靶点。这可能会通过在肿瘤部位局部输注这些 CAR-T 细胞来规避，因为它已在多项临床试验中进行（NCT01355965、NCT01897415、NCT03608618、NCT01837602）。

此外，mRNA 转染 CAR-T 细胞的必要重复应用存在一些危险，如上文详细描述的（例如，HAMA 反应可能的同种型转换）。此外，这种重复应用需要生产和储存多批 CAR-T 细胞，这可能很麻烦。此外，接受 mRNA 转染的 CAR-T 细胞治疗的患者不会诱导抗肿瘤 CAR-T 细胞记忆，如果肿瘤没有完全根除并且可能再次发生，这可能是一个问题。为了对 mRNA 转染的 CAR-T 细胞的适用性得出最终结论，需要对多项临床试验进行分析。为了减轻安全问题，另一个有前景的策略是最初使用重复注射 RNA 转染的 CAR-T 细胞来探测毒性，在没有严重副作用的情况下，改用永久转染的 CAR-T 细胞。

在clinicaltrials.gov 注册的使用CAR-T 细胞治疗实体瘤的所有临床试验的总结性审查表明，使用许多不同的CAR结构、应用途径和引入T细胞的额外功能遵循了许多策略。这可能表明，尚未找到用CAR-T细胞治疗实体瘤的理想策略。这也可以在报告这一点的试验的临床结果中看到；375名患者中只有52名有反应。尽管如此，使用CAR-T细胞治疗实体瘤蕴藏着巨大的机遇，需要进一步的开发和临床测试才能满足治疗此类癌症的高医疗需求。

4.1 临床结果

在clinicaltrials.gov注册的42项使用CAR-T细胞治疗实体瘤的临床试验中，临床结果可以从clinicaltrials.gov或通过pubmed.ncbi.nlm.nih.gov上的文献搜索检索（见表S1；还包括有关注射细胞数量、试验阶段、（估计）患者数量、试验状态、主要研究者和参考文献的数据）在临床肿瘤学杂志上发表的 ASCO 会议摘要中发现了一些临床结果。在报告临床结果的出版物中列出的 375 例接受治疗的患者中，13 例完全缓解，35 例部分缓解，4例混合缓解，121例疾病稳定，109例疾病进展，8例无疾病证据，5例不可评估，80例患者的临床结果未公开。

4.2 不良事件

本综述中描述的总共28项临床试验也报告了不良事件（表 S1）。不良事件非常多样（图 5）。一些不良事件是非常局部的，这可以通过观察肿瘤部位来解释（例如，治疗胶质母细胞瘤时癫痫发作，或治疗肝脏肿瘤时腹痛）。然而，也有更普遍的不良事件，例如：发烧、疲劳、恶心/呕吐、呼吸系统毒性/呼吸困难等（图 5）。尽管只有五项临床试验直接报告了血清细胞因子释放或细胞因子释放综合征 (CRS)（图 5），但这可能是低估了。对于急性淋巴细胞白血病(ALL)，据描述，在接受CD19-CAR-T细胞治疗的患者中，77%的患者普遍存在CRS。

据悉，在这些患者中，CRS的临床表现包括轻度发热伴头痛、肌痛等多种症状，但也有高热、低血压、急性呼吸窘迫综合征、弥散性血管内凝血、器官衰竭和死亡等症状。此外，还描述了C反应蛋白(CRP)和IL-6 值升高，以及多器官衰竭、凝血参数紊乱和血细胞减少的迹象。图5中列出的不良事件，以及表S1中详细总结的所有报告的不良事件数据，以及ALL患者CRS症状的描述，表明更多的细胞因子释放综合征病例是由带有CAR-T细胞的实体瘤。

图 5. CAR-T 细胞治疗实体瘤期间描述的不良事件（所有级别）的示意图概述。指出了报告特定不良事件的临床试验数量。

CAR-T 细胞治疗的另一个不良事件是CAR诱导的神经毒性，但是，这种神经毒性的机制尚不清楚。经毒性的症状包括一过性认知障碍、幻觉和谵妄，还有脑病和癫痫发作。 

因此，上述治疗胶质母细胞瘤患者的癫痫发作（NCT02209376）也可能是神经毒性的征兆。此外，一项试验描述了神经系统事件（NCT00730613），而在另一项试验中，不良事件之一是嗅觉先兆（NCT02208362），这两者都可能表明神经毒性。

参考文献：

The Landscape of CAR-T Cell Clinical Trials against
Solid Tumors—A Comprehensive Overview；doi：10.1111/sji.12910；doi:10.3390/cancers12092567。