实体瘤的过继细胞疗法

在过去十年中，免疫疗法彻底改变了癌症治疗领域。免疫细胞能够识别癌细胞的概念始于1900年代初期。然而，直到引入针对检查点分子的单克隆抗体，如细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）、程序性细胞死亡1（PD-1）及其配体（PD-L1），免疫疗法在癌症中的成功受到限制.过继细胞疗法(ACT)是一种个性化的癌症免疫疗法，涉及施用具有直接抗癌活性的免疫细胞。这种细胞治疗性给药的第一个实验来自国家癌症研究所的Rosenberg团队，通过给药从切除的肿瘤样本中获得并在体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。对患有高度免疫原性肿瘤（例如转移性黑色素瘤）的患者施用TIL显示出有希望的反应。

基因工程的进步使得在1980年代后期操纵T细胞受体成为可能，并首次尝试将细胞毒性淋巴细胞重定向到特定的肿瘤抗原。随着发现T细胞受体(TCR)细胞内亚基CD3ζ足以传递细胞的激活信号，随后尝试用单链变异片段(scFv)改变TCR的细胞外亚基α和β链一种免疫球蛋白以形成嵌合抗原受体(CAR)。将共刺激结构域（CD28或4-1BB）引入CAR可提高效力并延迟衰竭，从而改善抗肿瘤作用。另一种选择是对TCR的α和β 链进行基因修饰，以通过主要组织相容性复合物(MHC)呈递以自然方式识别肿瘤抗原。通过这种方式，T淋巴细胞能够识别由细胞处理的肿瘤相关抗原，而不仅仅是细胞表面呈现的抗原。

这三种ACT管理方法在过去10年共存，迄今为止在实体瘤中的成功有限。

肿瘤浸润淋巴细胞

1980年代早期的研究表明，在体外用重组IL2 (r-IL2) 激活的外周淋巴细胞（称为“淋巴因子激活杀伤细胞”-LAK细胞）输注能够在转移性肉瘤小鼠模型中诱导肿瘤消退。TIL、肿瘤细胞和r-IL2共培养的发展导致开发出一种比 LAK细胞强大50-100倍的产品。对转移性黑色素瘤患者的研究证实了这种治疗是有效的发现，并且还强调了淋巴耗竭化疗（环磷酰胺和氟达拉滨）预处理方案对减少调节性T细胞数量和促进归巢的重要性。TIL生成的进一步改进导致产生可以识别肿瘤细胞的特定TIL的更详细的协议。通过启动多个独立培养物，其中通过细胞因子释放试验测试每种培养物的抗原特异性和肿瘤反应性，并在辐照异基因外周血存在下用OKT3（抗CD3）抗体和IL-2扩增反应性培养物单核细胞。扩增培养物在患者输注前维持约14天。该方法已应用于临床试验，在黑色素瘤、非小细胞肺癌和宫颈癌等方面取得了可喜的结果（表 1）。

但是，TIL 的局限性是产品固有的。迄今为止所见的疗效似乎仅限于具有高肿瘤突变负担的“热”肿瘤。这导致下一波基因工程 T 细胞通过 CART 或 TCR 将淋巴细胞活化重定向到选定的肿瘤抗原。此外，还有一些尝试通过转导 CXCR2 趋化因子受体来改善 TIL 向肿瘤的运输，该受体正在 1 期临床试验中进行测试。

基因工程细胞：CART与TCR

目前有多种 FDA 批准的用于血液系统恶性肿瘤的CART细胞疗法，这些产品包含一个scFv，它通过细胞内CD3ζ和一个共刺激结构域（CD28或 -1BB）识别CD19。用这些药物治疗后的结果是CD19阳性细胞（包括非肿瘤细胞）完全耗尽，导致B细胞发育不全。需要注意这一点很重要，因为实体瘤的治疗将面临避免非肿瘤细胞对抗血液恶性肿瘤的挑战。为实体瘤模拟这种策略的尝试已经很广泛（表 2），目前正在进行40多项临床试验（表 3）。

与TCR相比，这种策略有几个优点。首先，CART细胞不需要靶抗原的MHC 呈递，因此不需要组织相容性。这使得产品设计更容易，因为它不需要HLA兼容性 。实体瘤CAR设计的关键方面之一是在癌细胞表面识别具有选择性表达的肿瘤相关抗原，以避免对正常细胞的损伤。用于CART设计的理想肿瘤相关抗原是新抗原。它们是正常组织不产生的高度免疫原性蛋白质。它们由肿瘤细胞中的非同义突变产生或由病毒插入引起的肿瘤中的病毒蛋白引起，例如由Epstein-Barr 病毒(gp350)引起的癌症。

靶向表面蛋白会出现一些问题。大多数针对实体瘤的 CAR T 研究产生的结果非常差，反应率在 0% 到 25% 之间（表 2）。这种缺乏效力有几个原因。一是靶蛋白的下调。由于靶蛋白通常对细胞的存活并不重要，因此在一些研究中，在处理后收集组织时会出现快速下调。例如，在一项针对胶质母细胞瘤患者静脉注射 CAR 抗 EGFRvIII 的临床试验中，作者发现在评估输注后肿瘤的 7 名输注受试者中，有 5 名 EGFRvIII 的表达水平下降 [18]。另一个问题是贩运到肿瘤床。肿瘤微环境具有允许肿瘤生长的免疫抑制条件，并可能阻碍 CAR T 细胞的归巢。众所周知，肿瘤会产生低水平的趋化因子，即使它们产生，它也可能与 T 效应细胞中存在的受体不匹配 [19]。

另一个主要障碍是靶抗原在正常细胞中的表达。例如，HER2 的表达在许多实体瘤中很常见，尽管也存在于一些正常细胞中。一名患者因肺上皮细胞中 HER2 的低组成型表达引发呼吸衰竭而死亡，导致一项 HER2（曲妥珠单抗外域）和 41BB.CD28.CD3ζ 信号传导内域 CAR T 细胞的临床试验停止 [20]。为了克服这个问题，开发了具有基于 FRP5 的外域和 CD28.CD3ζ 内域的第二代 HER2-CAR。对肉瘤患者的初步安全性评估表明没有明显的毒性，但 T 细胞的持久性有限，并且没有观察到抗肿瘤活性 [21]。一种提高 CAR T 细胞持久性的建议策略是 CAR 在病毒特异性 T 细胞中的表达 [22]。这些细胞可以通过其 CAR 提供直接的抗肿瘤活性，但也可以在天然 T 细胞受体 (αβTCR) 与专业抗原呈递细胞呈递的潜伏病毒抗原结合后接受适当的共刺激。该策略在 17 名接受病毒特异性 HER2-CAR T 细胞 (FRP5.CD28.CD3ζ) 的 HER2 阳性胶质母细胞瘤患者中进行了测试。一名患者实现了部分反应，并且细胞在外周血中存在长达一年。然而，有限的功效证实了需要改善这些细胞的扩增、功能和持久性[23]。

CAR 的替代策略是使用修改后的 TCR，因为它有几个潜在的优势。首先，抗原的种类要多得多，因为任何潜在的细胞内蛋白质都由 MHC 表达。此外，有可能靶向突变的癌症相关蛋白，从而增加对癌细胞的特异性[24]。还有一些限制，例如将 TCR 的使用限制在某些 HLA 亚型的 MHC 限制。此外，一些针对肿瘤产物（如癌胚抗原 (CEA)）的尝试未成功，原因是由于抗原在结肠粘膜中的正常表达而导致严重结肠炎的“靶向/肿瘤外”毒性 [25]。此外，工程化 TCR 与另一种抗原发生交叉反应的风险也令人担忧。一项针对 HLA-A*01 限制性 MAGE-A3 肽的 TCR 研究导致严重的心脏毒性（两名患者死亡），原因是识别了收缩肌肉中表达的 Titin 蛋白的表位 [26]。

然而，MAGE-A4 或 NY-ESO 等公共新抗原的使用在最近的临床试验中，特别是在滑膜肉瘤中取得了令人兴奋的成功结果。在使用表达 NY-ESO-1 c259 的自体 T 细胞的首次人体研究中，一种亲和力增强的 TCR 识别 HLA-A2 限制性 NY-ESO-1/LAGE1a 衍生肽，用于转移性患者滑膜肉瘤在几个月内显示出 50% 的患者 (6/12) 得到证实的部分缓解 [27]。使用针对 HLA-A2 限制性 MAGE-A4 的自体 T 细胞进一步显示了 ACT 在滑膜肉瘤中的价值，其中 7/16 (44%) 的患者使用 ADP-A2M4 实现了部分反应 [28]。如表 4 所示，该策略的抗肿瘤活性导致反应率显着提高。即使 CAR 以更高的密度表达时，全长 TCR 的敏感性也高于 CAR [7,67]。同时，发现 TCR 可介导较低细胞因子水平的释放 [74]。因此，与 CAR T 细胞疗法相比，TCR 疗法的细胞因子释放综合征风险可能更低，并且似乎在实体瘤中的 ACT 竞赛中处于领先地位。表 5 总结了正在进行的 TCR 治疗实体瘤的临床试验。

迄今为止，在实体瘤的ACT临床试验中看到的活动仍然引发了对该方法的风险/益处的质疑，特别是考虑到使许多患者不符合这些治疗条件的耗时程序，以及引起的潜在毒性 通过淋巴清除化疗、产品本身或在某些情况下使用的白细胞介素2。出于这个原因，正在研究几种策略来改善这种治疗方式（表 6）。

CART的本地交付

在保持抗肿瘤活性的同时提高耐受性的一种潜在替代方法是局部给药该产品用于全身扩展有限的肿瘤，例如间皮瘤或中枢神经系统恶性肿瘤。CAR T 细胞的中枢神经系统递送在 HER2+ 乳腺癌的临床前小鼠模型中是有效的 [29]。Brown 及其同事报告了一例复发性胶质母细胞瘤患者在将抗 IL13Ralfa2 CAR T 细胞输注到切除的肿瘤腔和脑室系统后完全缓解的病例。针对恶性胸膜间皮瘤患者的间皮素CAR通过胸膜内给药产生了25%的客观缓解率，其中两名患者通过PET-CT实现了代谢完全缓解。没有细胞因子释放综合征病例突出了该程序的安全性。

另一种有趣的方法是经常观察到某些实体瘤的寡转移性扩散，例如在结直肠癌中仅肝脏扩散的情况。在一项 I 期试验中，抗CEA CAR T肝动脉内经皮输注在5例CEA阳性结直肠癌转移瘤中进行了测试，全身毒性百分比低，无严重细胞因子释放综合征病例，实现了长期稳定一名患者的疾病。

Maus博士小组开发的另一种有趣的方法是对CAR T细胞进行工程改造以分泌双特异性抗体。他们开发了一种结构来驱动对EGFRvIII特异的CAR和针对EGFR的双特异性T细胞接合剂的表达。CAR T.BITE的局部给药完全消除了小鼠胶质母细胞瘤模型中的肿瘤，并且不会对人体皮肤移植物造成毒性。

这些令人鼓舞的结果增加了对该领域的兴趣，尽管与地方行政本身相关的困难可能会限制这种方法的影响。

安全开关

有可能在CAR中包含一个“安全开关”，以在出现不良副作用的情况下关闭活动。该策略已应用于预防半相合干细胞移植中的移植物抗宿主病。如果暴露于更昔洛韦，表达单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因（TK 细胞）的供体淋巴细胞将经历细胞死亡。

一个类似的策略是将iCasp9安全开关包含在供体T细胞中，用于通过施用生物惰性AP1903化合物激活的半相合干细胞移植。单剂量的化合物能够在 30 分钟内消除90%的修饰T细胞。这已经在不同的CAR模型（CD20、CD33、CD19、IL1RAP）中进行了体外和体内测试，迄今为止取得了有希望的非临床结果。避免引入转基因的其他建议替代方法是使用代谢开关。通过破坏嘧啶从头合成途径中的尿苷一磷酸合成酶，细胞增殖变得依赖于外部尿苷，并且通过调节尿苷供应来控制细胞生长。

另一种选择是使用阻碍CAR-T活性的药物。使用达沙替尼作为CAR-T细胞功能的潜在抑制剂源于该化合物能够阻断淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK) 的磷酸化，该激酶在受体接合后介导淋巴细胞活化。临床前研究表明，达沙替尼治疗可消除CART和T细胞接合剂双特异性抗体的细胞因子释放综合征。

其他替代方法，如组合靶抗原识别被提议作为降低毒性的潜在手段。使用这种策略，只有在细胞中同时发现两个靶标（PSMA+/PSCA+；ERBB2+/MUC1+ ；ERBB2+/IL13r+；CD19+/CD133+）时，CAR才会被激活，从而减少消除正常的非肿瘤细胞。然而，由于肿瘤细胞库“双阳性”较低，这种选择性的增加也转化为活性降低。