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瑞士苏黎世大学最新发文:中风后干细胞治疗需要遵循哪五项原则?

中风是世界范围内残疾和死亡的主要原因

我们既往报告过一些关于干细胞治疗中风的临床研究和案例,应该说干细胞治疗脑中风成功的希望还是很大,笔者身边接触的成功案例也不少,不过要想惠及所有人还有待时日。

本公众号后台有很多读者迫切想了解相关进展,因此我们一直很关注这部分的进展。

从科学的角度,因为脑和中风病理学的异质性,干细胞中风治疗的临床转化依然有很多难题需要解决方案,瑞士苏黎世大学的研究人员从他们的角度出发,提出了5个局限以及解决方案,虽然笔者不认同其中部分观点,但部分内容还是可供我们国内读者参考,特整理如下(如下图文)。

 

瑞士苏黎世大学最新发文:中风后干细胞治疗需要遵循哪五项原则?

  推进中风细胞疗法的五项原则

第一个原则:细胞来源

 

多种细胞来源都被认为可以成功地完成脑再生的细胞治疗,包括成体干细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSCs)(张等人2020)。然而,所有细胞类型都显示出其适用性的局限性

胚胎干细胞的优势在于可以无限增殖,但因为来自胚胎,所以它们受到严重的伦理关注,并且它们具有肿瘤形成风险。

随着iPSCs的引入,伦理问题被克服。iPSCs是通过各种重编程因子的异位表达将体细胞重编程为多能胚胎干细胞样状态而产生的(德·勒乌和塔克伯格2019)。虽然最初的方法使用整合慢病毒,但最近的发展可以通过游离载体或仙台病毒进行非整合重编程,这进一步降低了恶性细胞变异的风险,为iPSCs的临床应用铺平了道路(Hockemeyer和Jaenisch,2016年)。由于细胞培养物中的iPSCs可以无限扩增并主要分化成每一种体细胞类型,它们代表了用于治疗目的所需的任何类型人类细胞的无限资源。移植前,iPSCs通常分化为所需的神经细胞类型,因为具有复杂树突的成熟神经元,利用其易接近性和易隔离性,以促进脑再生。

间充质细胞组成的干细胞可能发挥营养支持作用和免疫调控,但不会分化成神经谱系,因此,它们不是细胞替代疗法而是营养疗法(Laso-García等人2019)。

原代神经干细胞可以整合到受损的神经网络中,但很难获得,因为它们通常是从接受神经外科手术治疗癫痫的个体的颞叶或脑室下区提取的。或者可以来源于流产的胎儿组织,并在永生化后克隆扩增(Kalladka等人2016)。

胚胎干细胞具有更强的分化成多种细胞类型的能力不适合细胞移植,优选使用神经前体细胞。神经前体细胞可以根据所需的前体和疾病病理进一步定制。例如,iPSC衍生的多巴胺能祖细胞在帕金森病的灵长类动物模型中显示出有希望的结果,该模型涉及黑质中多巴胺能神经元的变性(Kikuchi等人2017)。在中风中,丢失了更异质的神经细胞群;因此,来自较低分化阶段的神经元前体细胞有望获得更好的结果,并在临床前模型中更频繁地使用(Kokaia等人,2018)。

iPSC衍生细胞的移植也与肿瘤形成的风险相关(Yamanaka 2020)。然而,仔细的质量控制和有效的分化方案结合新的遗传安全开关技术(见第五个原则)可以大大降低iPSC衍生细胞的致瘤潜力。因此,我们认为基于iPSCs的细胞治疗是实现损伤或疾病后功能性脑再生的最有前途的方法,然而还需要一定时间的临床安全验证。

第二个原则:给药途径

 

如果移植物不能到达受影响的脑组织,那么产生最适合脑再生的细胞源就没有什么意义。

尽管目前的临床前细胞治疗研究支持局部移植大脑(Kokaia等人,2018年),超过一半的临床试验倾向于通过全身血液注射来施用细胞(Negoro等人,2019年)。

该领域面临着一个困境:局部实质内细胞移植有望获得最大疗效,但注射的相关风险高,这阻碍了其广泛应用。

全身注射是微创的,然而大多数细胞最终进入非病变器官,因此只能起到预期有限的治疗效果。

有趣的是,在不同类型的全身注射中也可以观察到递送的差异。人们普遍认为,在中风的啮齿动物模型中,静脉内注射细胞导致1%的细胞到达大脑(陈等,2001),而动脉内注射可能产生1%至10%(罗德里格斯等,2016)。当然,这些百分比可能根据细胞类型、脑损伤的时间和严重程度以及相关的血脑屏障(BBB)损伤而变化。

近年来,已经确定了几种机制,证明内源性外周免疫细胞(例如,中性粒细胞、淋巴细胞、树突细胞)穿过完整和受损的BBB (Marchetti和Engelhardt 2020)。这一过程涉及血脑屏障内膜的变化,以增加粘附分子的表达,减少紧密连接蛋白的存在。同时,它需要进入细胞的相应表面肽的表达来介导穿过BBB的滚动、粘附和渗出(Marchetti和Engelhardt 2020)。例如,SDF-1a/CXCR4轴线是穿越BBB的最重要的迁徙路线之一(Man等人,2012: 1)。在某种程度上,这些路径也被确定为将移植物导向受损大脑和脊髓的损伤部位(陈等,2015;希尔等人2004: 1)。因此,这些蛋白在移植物中的基因过表达或药理学诱导可能是一种有希望的方法,可以显著改善移植物向损伤处的定向迁移。

在大脑中,同样重要的是确保移植细胞在损伤部位的保留和植入。特别已知移植的干细胞具有高迁移率(在7天内,从移植部位起高达1.8mm;陈等2015)认为,这可能会导致大脑内出现不必要的滞留。对于局部移植,最有利的方法被证明是移植物的水凝胶包裹,这提高了保留和存活率,同时改善了移植物的成熟(Payne等人2019年)。然而,由于血管闭塞的风险,水凝胶包封对于全身应用的细胞难以实施。一种有希望的替代方法是通过细胞表面工程将移植物导向损伤特异性微环境。几项研究已经破译了动物模型中中风组织的转录和蛋白质组反应(Androvic等人2020;郑等人2020)。遵循癌症嵌合抗原受体T细胞疗法的原则(Rafiq和other 2020),结合中风相关肽可增强损伤部位移植物的归巢,并在系统应用后提供更有针对性和更有效的细胞疗法。这些方法目前也在其他急性损伤中进行了测试。例如,CD45阳性的骨髓干细胞与结合CD45和肌球蛋白轻链(存在于受损心肌细胞中)的磁性双功能抗体共同应用,显示心肌梗死后移植物保留率提高(Cheng等,2014)。

我们认为,未来的细胞脑内转运应该是全身性的,可能依赖于细胞对损伤环境的遗传或药理学功能化,以提高在靶区的归巢和滞留,同时确保注射过程中的低风险。然而,最佳靶点仍有待阐明和临床前验证。

此外,损伤环境是高度可变的,并且在脑损伤的急性和慢性阶段可以有很大的不同,所以在急性期和慢性期是否选择同样的输注途径有必要继续探讨

 

第三个原则:移植的时机

 

卒中后的标准临床程序是通过重组组织纤溶酶原激活剂溶栓或机械性血管内血栓清除术。尽管这些方法非常有效,但它们仅适用于少数中风病例,并且不是所有患者都获得了积极的结果。据估计,不到30%的中风患者在要求的狭窄治疗时间窗内到达,其中只有50%的患者适合急性临床治疗(方等,2010)。紧急治疗后,患者通常在医院停留至少24h,直到病情稳定,然后开始康复训练(AVERT试验协作组2015)。中风的脑组织在急性期形成一个不利的环境,具有高水平的炎症、氧化应激、细胞死亡和碎片,这降低了移植物的存活机会(施等人2019)。

因此,未来细胞治疗的最佳治疗窗口估计是从中风后几天到1周开始,以确保移植物的长期存活。因此,大多数临床前研究和一些临床设计在中风后的亚急性期进行移植物移植(Kelly等人2004;Kokaia等2018;Rust等2022)。这一阶段对于全身细胞注射特别有意义,因为中风可导致双向BBB开放,在中风后4至6小时和3天可传递性增加;这个时间窗口增加了更有效的移植物渗透到受伤部位(康和姚2020;韦伯等人2020)。

由于全球有超过1亿人患有中风,并且每二到三名患者中就有一名患有永久性缺陷(GBD 2016),考虑对慢性中风患者(此处定义为事件发生后6个月以上)进行细胞疗法也是很重要的。很少有临床前研究在啮齿动物模型中研究细胞在慢性中风的有益作用,部分结果是积极的(Bhasin等人2016;史密斯等人2012;Yasuhara等人,2009年)。一个原因是用传统的行为测试检测中风啮齿动物的长期缺陷的挑战。然而,每两个临床试验就有一个针对的是慢性中风患者,这可能也是由于临床紧迫性和患者可及性(Negoro等人2019年)。

在急性卒中向慢性卒中的转变中,损伤后6个月至1年,通常大部分受影响的神经组织和皮质脊髓束丧失;神经胶质瘢痕是由于血液供应异常而形成的;许多受损患者在恢复期经历平台期(韦克斯勒等人,2018年)。

虽然细胞因子的释放已被证明有助于改善急性中风后的功能恢复(Llorente等2021;王等2016),慢性卒中后细胞治疗的作用机制尚不明确。在组织丧失和重塑的这一阶段,通过细胞替代来增强功能恢复是干细胞不可能完成的。然而,神经和非神经干细胞移植已被证明能够启动血管生成,改变微环境,增强突触活性,并促进剩余脑宿主组织中的内源性神经发生(Kokaia等人2018)。所有这些观察都是基于这样的假设,即移植物分泌促进再生和可塑性的因子,从而改善整体功能恢复。在这些因素中,血管内皮生长因子和脑源性神经营养生长因子的释放已被确定为临床前和临床研究中的重要旁分泌机制(Bacigaluppi等人2016;Bhasin等人2016)。

这些研究的一个要点是,在中风后的急性期和亚急性期,干细胞治疗通过直接替代和营养因子有助于功能恢复。

在慢性期,细胞疗法的营养支持作用更可能是促进恢复的主要机制。

 

第四个原则:免疫相容性

 

免疫排斥是细胞治疗中的另一个关键问题

自体iPSC疗法(即应用患者自身体细胞产生的iPSC)可能是解决这一问题的最合适的选择(Yamanaka 2020)。事实上,首次将自体iPSC衍生的视网膜细胞应用于患有黄斑变性的患者的研究没有显示任何移植排斥的迹象(Mandai等人2017)。然而,符合良好生产规范(GMP)的单个iPSC细胞系的生产及其质量和安全控制的高投入和巨大成本(估计每细胞系80万美元(Rehakova等人,2020年))目前不允许对一系列患者进行自体疗法。此外,由于临床产生个体自身的iPSCs需要时间,自体方法不适用于急性疾病

同种异体移植物是来自同一物种不同个体的细胞或组织。这种方法提供了现成的潜力,并且已经建立了用于存储临床级细胞系的细胞库(Umekage等人2019)。京都大学目前正在进行一项使用同种异体iPSC衍生的多巴胺能前体细胞治疗帕金森病的临床试验(Takahashi 2020)。然而,这种方法需要使用免疫抑制剂进行长期治疗,这可能会产生严重的副作用,如移植后糖尿病、高脂血症、神经毒性或急性和慢性神经毒性(Wojciechowski和Wiseman 2021)。与器官移植不同,免疫抑制药物的治疗可能不是细胞疗法的终身疗法。

减少同种异体移植排斥反应的一种方法是人类白细胞抗原(HLA)配型。

另一种方式是创建具有最高免疫相容性的iPSCs,对其HLA基因进行靶向遗传修饰,产生所谓的通用细胞。虽然完全的HLA敲除可以保护移植物免受T细胞介导的免疫反应,但它会使移植物受到NK细胞的破坏(Trounson等人2019),然而,HLA敲除细胞也可以通过CD47的慢病毒过表达逃避NK细胞的监视,从而产生低免疫原性细胞(Deuse等2019)。另一种避免转基因表达的方法是在HLA-A和HLA-B敲除的iPSCs中保留单个HLA-C等位基因(徐等,2019)。HLA-C保留的iPSCs可以在体内外逃避T细胞和NK细胞的反应。据估计,12个HLA-C保留的iPSC系与超过90%的世界人口相容。

然而,免疫豁免细胞的产生会增加了不必要的恶性转化或病毒感染的风险,因为它们可能不会被免疫系统检测到(González等人,2020年)。因此,有必要开发将这种风险降至最低的工具,例如通过自杀基因的遗传工程。

 

第五个原则:风险最小化

 

基于细胞的再生疗法并非没有风险,移植前后的安全措施至关重要。

风险范围包括急性脑出血(在立体定向局部注射时)、细胞聚集或细胞诱导的栓塞(对于全身注射)以及功能性副作用(如癫痫发作和不自主运动)。

从长远来看,最大的问题是移植细胞形成恶性肿瘤,以及移植细胞沉积在不需要的组织中。

为了将这些风险降至最低,iPSC衍生的细胞必须经过各种质量控制实验。这已经从在GMP条件下生产和扩大临床级细胞开始,其要求包括在洁净室设施中工作和所有生产步骤的详细记录,以及使用经认证和符合GMP要求的无菌培养基、物质和设备(Gee 2018Rust等2022)。

临床级iPSCs的质量控制包括对细胞身份、基因组稳定性、多能性基因和标记表达、细胞形态和活力以及微生物无菌性的详细分析(Sullivan等人,2018年)。然而,如果由于iPSCs的不完全分化而使潜在的致瘤iPSCs留在移植物中,那么最好的质量控制也是无用的

因此,已开发了纯化分化细胞和/或去除残留iPSCs的技术(Fujita等人2022;胜川等人2016)。基于荧光激活细胞分选或磁激活细胞分选的符合GMP的细胞分选方法的发展使得iPSC衍生细胞的纯化可用于临床应用。事实上,在目前对帕金森病患者的一项试验中,施用的多巴胺能前体细胞通过具有荧光激活细胞分选的抗CORIN抗体而富集(Kikuchi等人2017)。另一种方法代表“RNA开关”,一种包含特定miRNA结合域的合成mRNA(Fujita等人2022)。根据mRNA开关的设计,miRNA的结合可以打开(mRNA被翻译)或关闭(mRNA不被翻译)。通过靶向细胞类型特异性miR-NAs-例如在iPSCs中高度表达的miR-302 a-5p-并通过使用编码barnase(一种导致细胞死亡的核糖核酸酶)的RNA开关,可以实现从培养物中选择性去除残余iPSCs。然而,即使是不含残留iPSCs的移植物也可能含有残留的分裂神经干细胞或祖细胞,这可能令人担忧,并具有移植物过度生长的风险。

此外,如原则2所述,全身应用的细胞可能最终出现在非期望的组织中。因此,移植后安全工具的建立是iPSC治疗的重中之重

安全开关系统的发展使移植细胞在发生不良事件时能够特异性消融。在前药介导的方法中,用编码将无活性前药转化为毒性化合物的酶的基因转导移植细胞(Sheikh等人2021)。最常用的组合是单纯疱疹病毒胸苷激酶的表达和前体药物ganci- clovir的治疗,该药物已被证明在输注自杀基因工程供体淋巴细胞后可消除白血病患者的移植物抗宿主病(Ciceri等,2009)。另一个方法是在移植细胞上应用单克隆抗体,利用其补体激活或抗体依赖性细胞毒性消除移植细胞。移植到小鼠体内后,用抗截短的人上皮生长因子受体的抗体治疗成功消除了嵌合抗原受体T细胞(Paszkiewicz等人2016)。第三种方法是在细胞移植物中表达iCasp9(诱导型胱天蛋白酶9),用生物学惰性物质AP1903处理诱导iCasp9的二聚化,导致通过凋亡去除移植物。

所有这些安全开关都有一个明显的限制,因为相应的药物或抗体的血脑屏障都是固定的。然而,特别是对于iPSC衍生细胞用于脑再生的应用,重要的是具有灵活可用的系统。在全身注射的情况下,并且为了去除在外周富集并且没有进入大脑的细胞,前药/抗体不应该穿过BBB。然而,如果大脑中的移植物显示恶性转化,则需要可透过血脑屏障的前药/抗体。因此,我们建议产生一种安全开关,其中前体药物以两种修饰形式存在:BBB通透型和非通透型。

 

结论

 

总之,我们认为,在可预见的未来,中风的细胞疗法具有增加患者治疗选择的巨大潜力。

全身和急性期注射最有希望成为适用于一系列中风患者的有效细胞疗法。

目前正在开发遗传和药理学工具,以确保精确靶向大脑受伤区域。作者认为,使用与大多数人群相容的“通用”iPSC来源的神经细胞系比个体化患者来源的细胞移植物更具可行性。通用细胞系不仅可以克服后勤和成本方面的障碍,还可以配备新型的基因安全开关,大大提高其安全性,并最大限度地降低癌变的风险。

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