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常见问题全整理！实验室如何培养好间充质干细胞

2022-12-08 13:33 • 干细胞疗法 • 阅读 70216

间充质干细胞（MSCs)，凭借其促进血管再生能力和免疫调节作用而受到广泛关注，也成为了众多难治性疾病的治疗新策略。诸多间充质干细胞临床试验已经证明了安全性和有效性，全球正在进行的间充质干细胞临床试验超过1000项，全球获批上市的干细胞药物中超过一半以上是间充质干细胞治疗产品。

富含间充质干细胞的人体组织

有人说，养细胞像养孩子，要小心翼翼地伺候。其实不然，养细胞像养祖宗才对。孩子仍可骂可教育，但如果你对细胞粗暴一点，他会分分钟不开心，让你难堪。相信不少伙伴也经历过干细胞生长缓慢、细胞活性差、细胞形态不规则、不同干细胞怎么鉴定等难题，不急，此时的失意都是启迪未来的财富。

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间充质干细胞培养的常见问题

在间充质干细胞研究中，细胞质量至关重要。而细胞培养问题是实验室无法避免的事情，时间长了，你总会遇到。没有遭受过培养问题的实验员一定没有养过多少细胞，但遇到培养问题不能妥善处理的也肯定不是“老司机”。

▉ 培养中的间充质干细胞聚团，是什么原因?

第一种情况，本身组织不能完全消化，不能完全避免；

第二种情况，很多细胞因子生长过程中会趋于聚团，即使没有组织块也会自己聚团长成克隆团的样子；

第三种情况，细胞长满了才传代：传代时从胰酶加入到终止不要超过2min，正常情况下我们消化30s或1min后看到细胞基本上缩圆了，再轻拍培养瓶侧面，细胞即呈沙状消化下来；如果细胞长满了才传代，胰酶未渗透进去，细胞就会呈一片一片的消化下来，后面也难以吹散，因此会影响到下一代细胞也会成团生长（传代时可把克隆团去除掉）。

‍▉ 间充质干细胞生长缓‍慢，怎么改善？

原因排查：

传代次数过多，细胞老化；
接种细胞起始浓度太低；
胰蛋白酶消化过度；
支原体污染。

解决对策：

尽量使用低代次细胞进行实验；
接种浓度：建议2.5~4×10*4个活细胞/cm2；
消化时在显微镜下看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧大量细胞脱落，此时立即终止消化；
定期做支原体检测，排除支原体污染。

‍▉ 间充质干细胞培养，可以用基础培养基加常规血清吗？

间充质干细胞的原代培养条件严格，对使用的血清和添加物都非常敏感，并非单纯的DMEM或者F12等基础培养基加常规血清所能替代。所以在培养细胞前，需要考虑该细胞培养是否需要添加特殊的成分，并且要做足预实验，选取最适合细胞生长的培养体系。

如赛业OriCell®提供的各类干细胞专用培养基，经16年干细胞培养经验的筛选优化，培养基添加了适合干细胞生长的优级胎牛血清，以及干细胞相关生长因子和非必须氨基酸能满足满足干细胞传代增殖生长中需要的特殊养分。

图依次为：成人骨髓间充质干细胞，成人脂肪间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞

用专用培养基养出来的干细胞有一定极性漩涡状、立体生长、细胞呈梭形、成纤维样排列，好的品质经得起客户长期检验。

▉ 间充质干细胞传代的注意事项有哪些？

胰酶浓度：推荐胰酶使用浓度为0.25%（含0.04%EDTA），使用之前需预热至37℃且pH值应维持在7.2左右。切忌消化过度（包括胰酶浓度过高、消化时间过长等），否则会导致细胞死亡、分化、状态变差，分化能力丢失等现象。细胞消化过程中需要在显微镜下观察细胞的消化程度，当看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱落，此时应立即终止消化，若细胞仍有大部分贴壁，可适当延长消化时间以避免消化不彻底的情况出现。

细胞的差异：不同种类的干细胞差异很大，特别是与肿瘤细胞株的差异更大，很多经验不可以直接使用，消化时需要仔细摸索最佳的时间。

接种密度：干细胞传代过程中接种密度至关重要，如果太低会导致细胞增殖缓慢，甚至导致细胞老化，而细胞的老化是不可逆转的。一般细胞接种密度为20000个活细胞/cm2即500000个活细胞/T25，不同的干细胞接种密度会稍有差异，比如hMSC，我们推荐的传代接种比例为1:2。

吹打细胞动作要轻柔：吹打动作不可剧烈，避免产生大量气泡，否则可能损伤和损失细胞。

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