HSC和IPSC衍生的CAR-NK细胞作为可靠的基于细胞的治疗解决方案

介绍

在过去十年中，免疫疗法已成为具有最高药物增长潜力的领域之一。它为治疗恶性肿瘤提供了越来越多的机会，而传统放疗或化疗的结果是有限的。在这些免疫疗法中，基于细胞的疗法特别有吸引力，因为它可以编程各种效应子功能以实现个性化治疗，甚至开发出副作用减少或不存在的自体治疗替代方案。基于细胞的免疫疗法已经见证了从未修饰的免疫细胞或细胞系向表达新功能的细胞的转变。嵌合抗原受体 (CAR) 的出现对此类发展起到了重要作用，因为它使免疫细胞与特定的癌细胞表面标记物结合。CAR蛋白由两个主要部分组成：一是抗原识别部分，主要是单链可变片段（scFv），由抗体重链可变片段（VH）和轻链可变片段（VL）融合而成。其次，内结构域将来自表面的结合信号转化为信号级联反应，最终激活效应细胞对癌细胞的裂解特性。

尽管自然杀伤 (NK) 细胞已被探索作为临床环境中的治疗替代方案，主要是 NK 细胞系，如 NK92 和同种异体 NK 细胞移植，但它们与 CAR 工程功能的使用直到最近才受到关注。iPS 细胞具有衍生所有成体组织的能力，包括免疫细胞，如 HSC、T 细胞和 NK 细胞。

目前，在临床前研究环境中，有多种分化方案可以从iPS细胞中获得免疫效应细胞。然而，直到最近才实现了用于区分 T 细胞和 NK 细胞的强大的无异种和定义的协议。iPS 细胞向效应免疫细胞分化的主要中间阶段之一是HSC阶段。HSC 负责成人所有血细胞的生成，包括先天性和适应性免疫细胞。HSC 的常规来源包括成人骨髓和新生儿的脐带。由于最先进的成人或脐带 HSC 扩增方案容易耗尽和分化，因此在提供高扩增产量的同时保持多能特性的方案对于 HSC 在免疫治疗中的使用至关重要。实现大量 HSC 的替代或补充方法包括使用 iPS 细胞，由于 iPS 细胞培养条件的稳健性，iPS 细胞具有很高的可扩展性。

在这篇综述中，我们介绍了 iPS 细胞或 HSC 母液的使用及其向 NK 细胞的逐步分化如何代表当前基于 CAR 细胞的免疫疗法技术背景下最有前途的策略。我们介绍了主要组件和前瞻性技术解决方案的当前挑战。

治疗细胞的来源

传统的CAR细胞疗法依赖于使用自体患者T淋巴细胞来表达工程功能。在考虑用于治疗应用的细胞来源时，自体细胞的使用存在各种挑战。

第一个挑战是，并非所有患者都能有效地动员数量适合治疗过程的功能细胞，尤其是那些在传统治疗周期后复发和难治的患者。这种限制对于任何类型的成熟效应细胞都是常见的，包括T和NK细胞。

第二个挑战是，源自患者的免疫细胞通常伴随着一定程度的功能障碍、衰老或衰竭，这导致源自它们的产品的功能性降低。

第三个挑战是，在当前的实践环境中使用患者自体细胞是时间密集型的，因此排除了有时间限制的患者；

因此，并非所有人都可以使用它。

例外情况对应于从储存的骨髓或储存的脐带血中获得的自体或同种异体 HSC。然而，使用自体骨髓存在被癌细胞污染的风险，特别是在血液系统恶性肿瘤中。这种风险在储存的自体脐带血组织中不存在，因为病理的发生在时间上和解剖上都是遥远的。

HSC 来源于目前正在评估脐带血或骨髓以制造 CAR-HSC，CAR-HSC 又可以分化为效应细胞，包括 CAR-T 和 CAR-NK 细胞。然而，使用 HSC 细胞源面临的一个主要挑战是初级池的扩增能力有限，同时保留了它们的干性特性。产生扩大未分化 HSC 池的新方法是促进 HSC 使用的有前途的途径。最近的研究追求在确定的培养条件下扩增 HSC。最理想的是，可以在治疗需要之前衍生、扩增和储存 iPS 细胞和HSC 来源，从而允许进行额外的验证和质量控制步骤。

此外，人类 iPS 细胞和最近的 HSC 可以进行多次基因组编辑迭代，用于患者定制的 CAR 疗法，为自体效应细胞提供无与伦比的优势。随着确定的细胞外基质（如玻连蛋白、3 层粘连蛋白 521, 和层粘连蛋白 511）的出现，人类 iPS 细胞的扩增产量大大提高，这些基质使原本复杂的培养系统转变为与标准细胞相当的自动化方法线培养系统。

此外，使用涂层微载体或中空纤维反应器允许在封闭的自动化培养系统中扩增高达20倍，产量高达7×109个细胞。这种扩展能力促进了 HSC 和 NK 分化协议的启动。据报道，从iPS细胞分化HSC的效率高达 19% CD45和CD34双阳性造血祖细胞。同样，据报道，NK分化在特定培养条件下的效率高达72%。1同时，传统的扩增方法据报道，原代 HSC 最高可增加899倍，而据报道脐血HSC衍生的NK细胞的分化纯度可达到90%。

治疗性免疫细胞

另一方面，在考虑效应治疗细胞的身份时，目前有两种主要选择：T 细胞或 NK 细胞。与 CAR-T 细胞相关的一些缺点包括细胞因子释放综合征 (CRS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS)、 以及器官毒性负担。自体 T 细胞的组成通过白细胞去除术获得的淋巴细胞因患者而异，从患者到健康个体差异很大。这导致 CAR-T 制造的起始材料不均一，因为 T 细胞未被选择以获得有利的CD8 和CD4阳性细胞比例，似乎在 CAR-T 细胞的治疗结果中具有重要作用。

使用预存自体或超供体同种异体 iPS 细胞衍生的 T 细胞可以解决异质性问题，因为CD8和 CD4 阳性细胞的比例可以在制造过程中进行调整。此外，T细胞受体 (TCR) 和MHC 匹配的超级供体集合作为分化的起始材料，能够制造一组可以覆盖大部分人群并提供免疫相容性的主池。在iPS细胞分化为任何免疫细胞之前，对它们进行工程化 CAR，包括T和NK细胞，然后将避免收集和遗传修饰异质自体患者细胞的需要，这可能具有潜在的基因组完整性问题。这为T细胞和NK细胞选项提供了实现更高免疫兼容性的途径。iPS细胞向T细胞的体外分化对模拟重组 TCR 的阳性和阴性选择提出了挑战。这方面已通过使用具有特征性重组 TCR 基因的 T 细胞衍生 iPS 细胞得到解决。同样，在 TCR 基因座上引入转基因，如 CAR，可使细胞进入TCR 敲除并消除潜在的 TCR 介导的免疫不相容性。在原代 T 细胞上外源表达的CAR 存在通过 TCR 和 CAR 进行并行信号传递的缺点，这可能会放大自身免疫性 T 细胞库。使用带有 TCR 的同种异体 T 细胞淋巴细胞确实存在 GVHD 的缺点，因为不相容性，包括 HLA、主要组织相容性复合体区域、同种异体识别的次要组织相容性目标以及影响免疫反应的整体遗传变异。另一方面，供体 NK 细胞表达缺乏或有限的GVHD诱导。

值得注意的是，最近的研究表明 NK 细胞和CAR-NK细胞不会诱导 CRS、ICANS 或 GVHD。此类研究可以在尚未达到的最大耐受剂量下进行，具有最高测试水平高达每公斤1×107个细胞。理想的治疗性 CAR 表达身份可能是 NK 细胞的身份，该身份可能来自 iPS 细胞或来自合适的HSC来源。这是因为从iPS细胞和HSC向NK细胞的分化方案已经相当成熟，实现了可重复的定义状态。 

如上所述，iPS 细胞和最近的HSC在保持其各自身份的同时呈现出有希望的细胞群可扩展性.此外，这种NK细胞来源不受患者与患者之间的差异、细胞衰竭或衰老的影响，并且不受与患者相关的病毒和癌细胞的污染。最后，这些细胞源可以接受各种制造质量控制层，与现成的生产兼容，并适用于超级供体库。在表 1 中，我们比较了 T 细胞和NK细胞宿主CAR疗法之间的主要对比领域。

表 1. CAR-T 和 CAR-NK 疗法的来源和效应子身份的比较

工程功能的集成方法

携带 CAR 的治疗细胞需要 CAR 基因的持续和持久表达才能发挥治疗功能。迄今为止，在 CAR 临床实践中最广泛使用的基因整合方法包括逆转录病毒，例如慢病毒。此类系统的使用依赖于明确定义的病毒包装方法。病毒整合系统已被表征，现在已知整合在常染色质区域随机发生，并确定了某些热点。迄今为止，尚未解决这种随机整合如何影响患者的临床结果。众所周知，这种系统携带的转基因可以整合到癌基因和肿瘤抑制基因中。这是其主要限制之一，因为基因工程过程中的转化风险无法避免。此外，病毒系统无法充分预定义制造细胞的每个细胞整合 CAR 的拷贝数。这导致在转基因细胞产量（群体中的高斯基因密度）与受控遗传剂量（群体中的泊松基因密度）之间进行选择。此外，已知慢病毒系统会受到染色质依赖性沉默，其中转基因的表达水平会随着时间的推移而下降。这种沉默过程可以影响逆转并介导复发。鉴于病毒系统的局限性，由设计者核酸酶介导的基因座特异性转基因整合为制造具有明确CAR拷贝数的效应细胞和一致且稳定的基因水平表达提供了广阔的前景。该断言确定了两个关键的制造组件：首先，要使用的设计者核酸酶，其次，用于整合的基因组位点。

核酸酶

在过去十年中，出现了各种精确的基因组工程工具，包括锌指核酸酶、TALE 核酸酶和CRISPR核酸酶。关于核酸酶，三个因素控制选择：制造核酸酶的简单性、转基因整合或敲除的目标效率以及避免脱靶的可靠性。关于核酸酶制造的简单性，锌指和TALE核酸酶的合成都很麻烦。另一方面，CRISPR核酸酶在技术上易于编程，因为它们只需要一个寡核苷酸成分即可与目标DNA特异性结合。关于在目标特异性和脱靶预防方面，三种类型的核酸酶表现出相似的性能。事实上，他们可以在不引入脱靶突变的情况下专门设计一个品系。

总的来说，由于其快速性，首选使用CRISPR核酸酶来初步定位合适的整合位点和验证实验，而使用锌指和TALE核酸酶更适用于经过验证的基因座和已知的整合性能。

积分位点

如上所述，转基因的随机整合可导致基因沉默和必需基因的破坏。安全港基因座是具有允许的表观遗传特征的基因组区域，允许跨谱系或特定细胞类型内的稳定转基因表达。经典的安全港基因座包括 CCR5 基因座、腺相关病毒位点 1 (AAVS1) 基因座和小鼠 ROSA26 基因座的人类直向同源物。

最近的研究表明，来自AAVS1安全港基因座的CAR蛋白持续表达。正如临床前研究应用所预期的那样，AAVS1允许CAR在T细胞上持续表达。或者，已知处于常染色体状态的谱系特异性基因座代表了全谱系安全港基因座的强大替代方案。T细胞中的TCR基因就是一个这样的例子。DNAse敏感性轨迹的映射以及基因体激活的表观遗传标记，如H3K甲基化，免疫细胞中的免疫细胞将进一步解锁安全基因座，以持续表达治疗基因，如CAR。

在这方面，具有充分表征的精确基因工程工具和方法的iPS细胞和 HSC 已成为具有更大潜力的CAR疗法的合适细胞来源。上述基本原理支持安全港基因座的精确基因组工程方法，作为整合CAR基因的有前途的方法。在iPS细胞和HSC中设计这样的基因座，允许稳健的基因操作，结合细胞类型特异性向 NK 细胞分化，将为现成的治疗开发提供极具吸引力的替代方案。

使用的CAR结构

可以通过调节 CAR 蛋白的结构来制造更有效、更安全的基于 CAR 细胞的疗法。了解 CAR 功能域的修饰如何影响下游信号通路、转录输出和细胞特性，对于开发下一代基于细胞的疗法至关重要。

CAR 蛋白模块可分为两个主要部分：第一，介导信号转导的内域，第二，抗原接合组件或结合介导的转导组件。

内域

随着大量CAR蛋白类型的出现，人们注意到虽然一些CAR呈现依赖于结合的信号级联激活，但其他的则具有组成型活性。例如，基于 CD28的CAR蛋白导致与LCK的组成型关联和CAR CD3ζ结构域的组成型磷酸化。这种组成型激活与 T 细胞耗竭和临床表现降低有关。这种组成型活性 CAR 蛋白的影响已在效应免疫细胞中表现出来；然而，在分化之前对祖细胞（如 HSC 或 iPS 细胞）的影响仍有待发现。可以推测，这些途径可能会引导或阻碍分化过程本身，调节分化产量和最终细胞身份。一些研究支持这一观点，因为包含 CD28 结构域的 CAR 有利于 T 细胞向效应类型分化，而 4-1BB 结构域有利于记忆 T 细胞身份，当已经在 T 细胞类型谱系中时。这可能导致显着不同的临床反应。因此，在iPS细胞或HSC祖细胞被设计用于表达CAR蛋白的环境中，CAR应该以其下游途径的明确抗原诱导开启状态来计算。仍有待确定这些内域组合中的哪些提供了适当的开关转换。或者，在存在泄漏关闭状态的情况下，这些内域中的哪些与iPS细胞或HSC祖细胞及其分化中间体中存在的转录网络兼容。最终，一个重要的临床前目标是确定可最大限度提高 HSC 和 iPS 衍生 NK 细胞治疗活性的内域组合。

 抗原接合成分

一些研究表明 CAR 的 scFv 组分的结合亲和力在减少副作用方面起着重要作用，并且具有低结合亲和力的CAR在临床上是有益的。这种优势似乎仅在效应细胞身份水平和临床使用期间有益.然而，当使用超级供体祖细胞作为iPS细胞或HSC时，scFv的亲和力可能不会影响制造效率。

涉及NK细胞的临床试验

迄今为止，已有超过1340项涉及NK细胞疗法的临床试验。绝大多数这些试验都集中在血液系统恶性肿瘤上，这是因为治疗性NK细胞更容易接近致瘤细胞（表 2）。幸运的是，越来越多的CAR-NK细胞临床试验针对实体恶性肿瘤，如胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌。大多数临床试验使用同种异体 NK 细胞，主要来自健康供体和NK细胞系，如NK92。然而，有一小部分临床试验评估源自CD34阳性脐带血细胞的NK细胞（表 2）。后一种方法特别有趣，因为它与现成的解决方案兼容，包括超级捐赠者骨髓库和超级捐赠者iPS衍生的HSC。尽管有涵盖细胞因子诱导的记忆样 (CIML) NK细胞的临床试验，但它们与CAR结合的结果仍有待评估。CIML NK细胞最近被描述为循环血液的组成成分，并且HSC以及iPS细胞向 CIML NK 细胞的分化提供了潜在的协同作用。有希望的是，有一些利用iPS细胞作为NK细胞来源的临床试验，其中一些也表达CAR（表 2）。

表 2. 涉及原代NK细胞、NK细胞系、HSC和iPS细胞衍生的NK细胞和CAR-NK细胞的临床试验

结论

在这里，我们展示了细胞来源对于开发下一代细胞免疫疗法的重要性，以及不受变异性和风险因素影响的细胞来源如何推动更安全的治疗替代方案的开发。我们支持iPS细胞和HSC是用于生产现成NK细胞的更安全的细胞来源。我们还总结了关于NK细胞作为基于CAR疗法的载体的优势的累积证据。我们展示了CAR结构域在HSC或iPS细胞来源分化中的潜在作用，以及 CAR 基因在确定的遗传剂量下整合到精确基因组位点中如何有助于规避与病毒整合方法相关的缺点。

10.1002/sctm.20-0459