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免疫原性临床前评估,免疫细胞功能实验要点

 

抗药物抗体(ADA)是蛋白药物成功临床应用的一个主要障碍,降低患者的治疗效果和安全性。预测抗体药物的免疫原性,对于临床试验顺利进展以及药物临床使用极其关键。

影响蛋白类药物免疫原性的因素,包括治疗性蛋白的内在和外在特性,患者相关因素(HLA单倍型、免疫状态)、治疗环境、药物递送方式和作用模式(MoA)等。

 

生物信息学评估

 

生物信息学主要用于预测药物氨基酸序列中潜在的T细胞表位

 

系统扫描蛋白质的一级结构,计算可以与HLA结合的9-15mer表位并评分。在药物开发阶段,减少从苗头化合物(Hits)到候选药物(leads)数量,同时减少将来进入临床的候选药物的潜在T细胞表位,降低临床试验中ADA的发生。

 

单纯靠HLA亲和力进行预测,会大大高估T细胞表位数量,需要考虑更多的因素,如

 

影响9-15ʹmer氨基酸序列成为功能T细胞表位的因素:

 

  • HLA分子形成复合物的稳定性
  • APC对于表位的自然处理
  • 序列-MHC-II槽特定的CD4+T细胞的存在

 

HLA结合序列不能成为T细胞表位的其他因素:

 

  • 亲和力太低,无法引起免疫反应,

  • 阴性选择已经清除了特定的T细胞,

  • Treg介导的外周耐受。

MHC洗脱肽结合质谱分析获得基础数据,再对算法系统进行教育,使其获得判断T细胞功能表位的能力。

 

有一些相关技术被开发:

  • MixMHC2pred:集成了等位基因特异性基序,肽长度和结合核心偏移偏好,使用超过99000个独特的洗脱肽,进行MoDec分析(一个新的肽深度基序反褶积概率框架)。
  • MARIA:基于多模态递归神经网络算法,包括肽序列、基于侧翼残基预测信息的切割分数和HLA结合分数,两者都来自新的预训练神经网络。Maria还包括基因表达水平,这是其特有的。
  • MAPTAC:基于HLA-II等位基因纯化结合肽,通过LC/MS分析肽序列,预测肿瘤HLA-II结合肽。

     

免疫原性临床前评估,免疫细胞功能实验要点

 Immunity2019,51,766–779

  • NNAlign_MAC:MHCII相关肽蛋白质组学(MAPPs)结果与免疫表位数据库(IEDB;http://www.iedb.org)收集的传统亲和数据的整合,提供HLA结合评分,预测药物CD4+T表位。

 

免疫原性临床前评估,免疫细胞功能实验要点

 

NNAlign_MAC 蛋白质药物(英夫利昔单抗)免疫肽谱分析Front Immunol. 2020;11:1304.

 

上述方法有特定的应用场景,且没有整合ADA的临床检测数据,因而不可以盲目使用。

 

免疫细胞功能实验

 

1. DC细胞成熟试验

 

可以激活DC等APC细胞,是预测生物药产生ADAs的指标之一。监测DC细胞成熟可以作为监测药物免疫原性的工具。

moDC可以通过几种方式生成。从人血液中分离PBMCs后,用磁珠分选单核细胞。加入GM-CSFIL-4,诱导纯化单核细胞分化为不成熟moDCs。

 

使用生物药攻击moDCs,监测攻击后15分钟到48小时的细胞参数

 

  • 4-48小时,检测细胞表面标记物表达(至少包括CD83、CD80、CD86和CD40)
  • 24-48小时,检测细胞培养上清细胞因子分泌(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和TNF)
  • 15-30分钟,参与DC成熟的信号通路蛋白的磷酸化,如Akt,ERK1/2和Syk,
  • 早期(6-24小时)mRNA定量细胞因子和/趋化因子

 

对照组设定

 

  • 阴性(单独培养基)
  • 阳性对照(KLH、脂多糖(LPS)滴定或成熟鸡尾酒激活剂)
  • 一个低免疫原性(如贝伐单抗)和一个中高免疫原性(如ATR-107)标准参照

 

对结果的评估取决于所使用的方法,通常涉及对至少10个捐赠者的统计分析。DC激活细胞表面标记物增加50%或100%。

 

2. T细胞功能试验

 

体外T细胞活化试验,试图通过测量CD4+T细胞对药物T细胞结合结构域的活化情况,评估治疗性蛋白和多肽的免疫原性风险。

 

T细胞功能检测通常由四个不同的成分和顺序步骤组成:1)抗原攻击、2)细胞培养成分和刺激、3)检测结果读出、4)数据分析

 

试验的关键点

 

1)抗原攻击

 

抗原剂量/浓度

  • 不会导致细胞毒性的优化量/浓度;
  • 幼稚T细胞-树突状细胞和巨噬细胞相互作用以及随后的激活是抗原剂量依赖性的
  • 供体间EC50抗原的可变性(100倍或更多),需要诱导最大增殖的50%

 

对于记忆/回忆反应

单次攻击就足够了;攻击后24-72小时细胞因子读数,第7天的增殖读数。

 

对于初始反应

产生抗原特异性T细胞需多个连续抗原攻击;孵育时间可能在7到28天之间变化。

 

抗原作用模式

基于抗原性和靶点作用,细胞和检测形式将发生改变。

 

2) 细胞培养成分

 

  • 培养基:RPMI, DMEM, Earle’s modified
  • 血清:AB血清、自体血清、无血清
  • 刺激抗原
  • 细胞因子:IL-2, IL-6, IL-7, IL-12,IL-15, IL-17, IL-21(考虑:剂量、时间点、持续时间)
  • 用于DC成熟的细胞因子:IL-4、GM-CSF和LPS,减少旁观者T细胞反应,并使用IFN-α减少背景
  • 外源性刺激:LPS、TNF-α、IFN-α、CD40L、成熟鸡尾酒刺激未成熟树突状细胞

 

3)结果读取

 

ELISPOT 和 Fluorospot:多重检测,根据细胞因子谱分析Th亚型。是短期记忆T细胞分析的理想选择,可以识别记忆T细胞的低频T细胞前体。

T细胞增殖

T细胞活化的标记物;荧光标记物(如CFSE);DNA增殖标记物和Ki67的细胞内染色;最适合延长刺激时间以产生初始T细胞反应。

使用基于流式细胞术分析:细胞表面标记物如CD154(表明抗原特异性CD4T细胞活化)或细胞内细胞因子染色(作为T细胞活化的标记物)

利用Luminex®和MSD等平台分泌细胞因子panel

 

3. B细胞功能分析

 

评估特定生物药品激活CD4+T细胞的潜力,它们激活B细胞,并诱导其分化为产生ADA的浆细胞。

 

B细胞表位和产生生物药品特异性IgG的B细胞数量,是免疫原性风险的重要标准。然而,免疫原性风险评估中的B细胞成分目前被大大忽视了,主要受限于体外评估B细胞的技术。

 

B细胞表位

 

生物信息学预测方法已经被开发,如SEPIa,一种结合了13种不同序列衍生特征的算法,包括氨基酸组成、亲水性、溶剂可及性和主链灵活性。研究发现,SEPIa的性能优于基于序列和基于结构的现有方法,但与T细胞表位预测相比,仍然有局限。

 

免疫原性临床前评估,免疫细胞功能实验要点

 

产生特定IgG的B细胞数量

 

迄今为止,只有基于ELISpot/FluoroSpot的检测方法,被报道用于体外评估生物药品特异性IgG-B细胞。它用PBMCs进行实验,报告分泌靶抗原特异性抗体的B细胞的数量。

 

该实验通过用激活鸡尾酒(通常至少包含一种TLRs激动剂和IL-2)启动B细胞,将记忆B细胞分化为浆细胞。

 

这些浆细胞分泌大量的抗体,可以被捕获在PVDF膜上,可通过两种不同的方式进行:

1)靶抗原可直接固定在PVDF膜上,并与分泌的抗体结合,该抗体可使用标记的抗Fc抗体进行检测和定量;

2)使用抗Fc抗体捕获B细胞衍生浆细胞分泌的所有抗体;通过比色或荧光检测进行检测和定量。后一种方法的优点是,抗体分泌细胞的总数可以与抗原特异性分泌细胞的数量一起确定,并能够计算记忆B细胞群中抗原分泌细胞的频率或百分比。该检测程序也可以修改以检测各种抗体类型(IgA、IgE、IgG1-4和IgM)。

 

目前仅限于评估记忆B细胞反应,但B细胞ELISpot/FluoroSpot试验可以成为一种工具,以评估和比较在生物药品开发的早期阶段,未使用药物的健康供体中是否已存在交叉反应抗体?

 

目前还没体外模型可用于幼稚B细胞,由于涉及类别转换的复杂过程,从低亲和力IgM的产生转换为与ADA反应相关的高亲和力IgG抗体。

 

模型动物

 

标准的动物模型不合适免疫原性研究,因为任何人类治疗蛋白都可能被识别为外源性蛋白。

 

人源化HLA转基因小鼠表达人类MHC基因,因此可以有一个更接近人类T细胞库。但这些模型主要用于研究具有已知风险等位基因的自身免疫疾病,在免疫原性预测方面的价值有限,因为它们不能反映人类群体中MHC等位基因的多态性,而TCR库仍然完全是小鼠。

 

目前,最好的模型是人源化小鼠(即Human Immune System,“HIS”),通过对免疫缺陷小鼠进行骨髓消融,并用从胎儿肝脏或从脐带血(更常见)中获得的人类造血干细胞重建而产生。到目前为止,因为成本高、时间周期长,人源化小鼠还没成为临床前免疫原性风险评估的首选平台,集中在具有高免疫原性风险的生物疗法的研究/评估上。

 

免疫原性临床前评估,免疫细胞功能实验要点

 

参考文献

  1. Abelin et al., Defining HLA-II Ligand Processing and Binding Rules with Mass Spectrometry Enhances Cancer Epitope Prediction, Immunity2019,51,766–779
  2. Barra C, Ackaert C, Reynisson B, Schockaert J, Jessen LE,
    Watson M, Jang A, Comtois-Marotte S, Goulet J-P, Pattijn S,
    et al. Immunopeptidomic data integration to artificial neural networks enhances protein-drug immunogenicity prediction. Front
    Immunol. 2020;11:1304. doi:10.3389/fimmu.2020.01304.
  3. Dalkas GA, Rooman M. SEPIa, a knowledge-driven algorithm for
    predicting conformational B-cell epitopes from the amino acid
    sequence. BMC Bioinform. 2017;18(1):95. doi:10.1186/s12859-
    017-1528-9.
  4. Axel Ducret, Chloé Ackaert, Juliana Bessa, Campbell Bunce, Timothy Hickling,
    Vibha Jawa, Mark A. Kroenke, Kasper Lamberth, Anaïs Manin, Hweixian L. Penny, Noel Smith,
    Grzegorz Terszowski, Sophie Tourdot & Sebastian Spindeldreher (2022) Assay format diversity
    in pre-clinical immunogenicity risk assessment: Toward a possible harmonization of antigenicity
    assays, mAbs, 14:1, 1993522

     

发布者:木木夕,转转请注明出处:https://www.cells88.com/cells/myxb/8448.html

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