5位外泌体行业专家开年大聚首｜畅谈外泌体技术临床应用现状与前景展望

2013年三位科学家因囊泡运输调控机制获得诺贝尔奖后，相关领域的研究迅速成为热点。特别是近几年外泌体相关基金和文章屡创新高，全球科研大咖纷纷扎堆此领域，有关外泌体载药、诊断、预后监测、免疫疗法等方向的文章陆续发表在Cell、Nature等各大顶级期刊上。外泌体已成为生命科学/临床医学研究的一大热点。目前该领域累计已经发表了8,000余篇Medline论文，而我国的外泌体领域研究更是如火如荼，国自然资助项目数量均呈现井喷式增长，2019年外泌体国自然项目资助数达581项，总金额达2.45亿。

外泌体的研究领域十分广泛，除了癌症领域，在神经系统疾病、心血管等领域也均有研究进展。在此背景下，外泌体研究必然是医生科学家切入的最好时机。一方面，外泌体的机制已经比较清楚；另一方面，针对外泌体在不同疾病中的干预效果研究还远远不够，更重要的是，针对外泌体研究资助的研究项目仍在迅速增长。

为此，测序中国与国际细胞外囊泡学会（ISEV）教育委员会执行主席、中国研究型医院学会细胞外囊泡分会（CSEV) 副主委郑磊教授、北京大学肿瘤医院沈琳教授、广东省人民医院张绪超教授、第三军医大学大坪医院心血管病专科医院曾春雨教授、北京恩泽康泰CEO孔关义进行了深入对话，从不同疾病领域畅谈外泌体技术的临床应用现状与难点。

南方医科大学南方医院-郑磊教授

国家自然科学基金杰出青年基金获得者，广东省医学领军人才，珠江学者特聘教授 南方医科大学南方医院检验科主任 广东省重大疾病快速诊断生物传感技术工程研究中心主任；国际细胞外囊泡学会（ISEV）教育委员会执行主席，世界华人检验与病理医师协会副会长，中华医学会检验分会常委，中国研究型医院学会细胞外囊泡分会（CSEV) 副主委，广东省医师协会检验医师分会主任委员等。

测序中国：您作为CSEV创建者，积极推动中国囊泡研究与应用，与国际囊泡学会深度接轨，同时您课题组也一直专注于外泌体研究和转化，硕果累累。能否分别介绍一下？

郑磊教授：2017年由南方医科大学珠江医院王前院长牵头，我作为副主任委员兼秘书长依托中国研究型医院学会成立了国内第一个细胞外囊泡学会—中国细胞外囊泡研究与应用专业委员会（CSEV），专委会已连续组织四届学术年会，非常高兴的是每年参会人数都是成倍增加的。尤其是在新冠疫情防控压力剧增的去年冬季，CSEV第四届学术年会改为线上举行，会议注册人数达2,100余人，点击量高达5万人次，关注度创历史新高。我们依托学会，联合国内囊泡研究领域学者，在2019年第三届全国细胞外囊泡大会上发布了由CSEV组织编写的国内第一本专业书籍《细胞外囊泡基础研究与临床应用》，累计发行3,800册，为本领域初学者提供全面的学习资料。此外，在2020年全国积极抗疫的大环境下，我们学会携手北京恩泽康泰推出了《外泌体大讲坛》系列线上直播课，目前已经累计举办26期，给相关研究者尽可能提供学习交流的平台。

为了与国际细胞外囊泡研究接轨，我们始终坚持走出去引进来方针，在深入参与ISEV学会领导工作的同时，积极邀请国际囊泡领域知名学者参与中国细胞外囊泡学术活动。1.走出去方面：我曾连续两届当选为国际细胞外囊泡学会（ISEV）Board of Director 执行委员，并于2020当选为ISEV教育委员会执行主席，积极推进ISEV全球教育培训，也在亚太地区积极推进细胞外囊泡研究与应用，进一步提升了中国在国际细胞外囊泡研究领域的影响力。2.引进来方面：连续三年在CSEV学术年会期间举办“ISEV走进中国”环节，特别邀请到ISEV的主要领导者和知名学者进行开幕致辞和大会报告，包括：ISEV主席、JEV主编Jan Lötvall、ISEV Science/Meeting执行主席、JEV Associate Editor Kenneth Witwer；ISEV标准化委员会联合主席Rienk Nieuwland；ISEV Communication执行主席 Susmita Sahoo等ISEV核心成员。此外，在国家自然科学基金应急管理项目的支持下，我们在广州成功承办了ISEV在中国的首个Workshop（2018 ISEV Guangzhou Workshop——EV-based Clinical Theranostics），在国内外产生积极影响。

本课题组研究工作也长期围绕细胞外囊泡来开展，我们成功鉴定出了系列新型囊泡疾病标志物，同时创建了微液滴数字化定量分析等精准检测新技术，近年来，研究成果发表在J Extracell Vesicles、Nano Lett、ACS Sensors、Biosens Bioelectron等专业期刊多篇，多项研究成果入选国内外学术会议交流。

测序中国：您是如何看待外泌体在临床医学的应用前景？

郑磊教授：外泌体在临床医学中具有巨大的应用前景，主要包括疾病诊断和治疗两个方面。在诊断方面，尤其是在血液与体液等液态标本中检测外泌体标志物从而获取疾病相关信息的实验诊断，比如肿瘤早期诊断，疗效的预后评估等，美国Exosome DX公司已经有基于尿液的外泌体诊断产品进入NCCN指南；在治疗方面，研究报道了，天然未经过工程化改造的外泌体在对其有较多摄取的脏器相关疾病中具有治疗作用，比如体表相关的如衰老/脱发等、肝脏/肾脏/脾脏/肺部等疾病和肿瘤等。而工程化改造的外泌体很可能会增加外泌体的适用范围，甚至具有作为临床药物的应用潜力。2015年成立的Codiak公司是第一个成功在纳斯达克上市的专注于外泌体载药应用转化的公司，另外Evox和Capricor等许多新锐公司也都专注于外泌体疗法的开发，并吸引了国际知名制药公司和资本的支持；在国内，也有越来越多公司进军外泌体应用转化领域。

测序中国：近年来科研中对于外泌体的研究越来越活跃，您有什么建议或意见想提给已经或准备涉及外泌体领域的学者？

郑磊教授：目前，针对外泌体的研究，主要有以下几个方面：1.针对外泌体的定义，来源，合成与分泌、摄取等机制研究；2.针对微环境尤其是从外泌体角度解释疾病发生发展机制的研究；3.寻找疾病诊断和预后生物标志物；4.将外泌体作为药物载体类的研究。不管是研究哪一个方向，都有很多科学问题待解决，系统深入的研究对整个行业的发展都具有推进作用，例如：目前外泌体的分离方法较多，具体研究中采用哪一种较合适，还需要根据研究对象和目标确认。分离后的外泌体需要进行鉴定，这一点也需要行业达成共识。总之，针对外泌体研究的每一个环节，都需要我们逐步建立标准和共识，逐步规范。

北京大学肿瘤医院-沈琳教授

北京大学肿瘤医院副院长、北京市肿瘤防治研究所副所长、消化肿瘤内科主任、I期临床试验病房主任、苏州工业园区康林肿瘤科技创新研究院院长、2019年北京学者，卫健委胃癌/结直肠癌诊疗规范执笔人/组长，中国医师协会外科医师分会MDT学组主委，中国抗癌协会胃癌专委会秘书长，大肠癌专委会副主委，肿瘤精准治疗专委会侯任主委，中国临床肿瘤学会临床研究专委会主委，中国医药创新促进会抗肿瘤药物临床研究专委会副主委，北京癌症防治学会轮值理事长，中国老年医学学会肿瘤分会会长

测序中国：液体活检技术CTC、ctDNA技术在肿瘤临床应用逐步规范和成熟，外泌体作为后起之秀最近发展很快，您如何看待液体活检新贵外泌体技术的发展前景？

沈琳教授：液体活检技术目前在肿瘤临床领域最主要的应用价值在于诊断和监测，尤其对于精准治疗而言，对治疗靶点和标志物的及时检测是非常重要的，有助于临床医生提前做出治疗决策，选择合适的药物方案，避免耐药或者严重不良反应的问题，为患者争取宝贵的时间。同时在治疗过程中，液体活检技术也能够实时反映患者的病情变化，以便及时调整治疗方案。

液体活检的本质都是对患者体液中生物标志物的探索，而外周血就是最可得、提供信息最多的生物样本，目前肿瘤临床应用中比较成熟的液体活检方向以外周血为主，包括CTC和ctDNA在临床的应用都非常深入。但CTC和ctDNA各自都存在一些优势和劣势，例如CTC是循环肿瘤细胞，能够直接反映肿瘤的存在和复发转移的可能，更加直接，同时携带从DNA、RNA到蛋白的完整生物信息，但缺点是数量太少，且稳定性差，无法保存，很难进行回顾性的研究。ctDNA在外周血中广泛存在，相对来说更加稳定，易于保存，数量多，因此检测起来有天然的优势，目前国际国内都有大量基因检测公司进入这一领域，其中多家佼佼者也已经上市，并且基于NGS的临床诊疗指导也已经逐步被多种肿瘤指南所采纳并推荐，但缺点在于只能检测DNA层面的变异信息，离执行生物学行为的转录组和蛋白水平还有距离。外泌体检测是近几年逐步兴起的方向，胞外囊泡这一概念2013年就获得了诺贝尔奖，近几年也获得了越来越多的关注，外泌体从活体细胞分泌出来，可以携带多种DNA、RNA和蛋白多种组分，在患者血液、尿液、腹水胸水等体液中广泛存在，且能够在低温条件下稳定保存，可以说综合了CTC和ctDNA的优点，因此对临床转化意义是重大的。近几年科学研究发展迅速，文章课题基金也在迅猛增加，这也加速了转化，临床试验翻倍增长，并且国外有公司已经有产品进入FDA绿色通道，同时治疗产品也进入临床研究，说明了转化的前景还是非常巨大的。

测序中国：外泌体在肿瘤应用的方向有哪些？

沈琳教授：外泌体在肿瘤中的应用前景非常广阔。在液体活检层面，外泌体相对易于获取，携带足够的生物信息，因此能够携带肿瘤早期标志物信息，提供早期诊断的机会。对于中晚期患者而言，外泌体能够用于治疗标志物预测，帮助临床选择治疗方案，同时在治疗过程中提供动态监控，帮助更好地获益。此外作为囊泡，外泌体载药治疗也是正在探索的方向。外泌体可以向肿瘤细胞运送组分，影响肿瘤的进展、转移和耐药等行为。而反过来说，也可以将外泌体作为药物递送的媒介，为其构建靶向性，使其用于递送治疗剂，从而扩展现有精准治疗的给药方式。

测序中国：外泌体转化还有哪些问题和不足？针对这些问题有哪些改善的建议？

沈琳教授：首先，外泌体只是载体，关键的生物学功能在于内含物，因此关键在于对外泌体内含物影响肿瘤发生、发展、药物应答的机制，以及作为诊断和治疗标志物的价值进行充分研究，这和整个肿瘤研究领域的发展是分不开的。其次，外泌体作为微小囊泡，生物稳定性存在一定波动，在分离提取方面有诸多的方法，可能对结果产生一定的影响，因此需要逐渐开发、推广统一、高效的标准。此外，由于外泌体概念相对较新，研究基础还不够，且投入资助不够，公司参与度不够，临床队列研究不够，因此外泌体在应用方面目前也还在发展之中，在临床应用方面目前相对CTC和ctDNA还很稀缺，有待更多的规范建立。

但目前已经有越来越多的研究者开始重视外泌体，希望未来业界不断深入研究外泌体相关机制的基础上，开发稳定方法，建立标准和质控，申请大型课题支持，加强基础研究、企业合作和临床转化的联系，更好地推动外泌体在肿瘤领域的发展和应用。

广东省肺癌研究所-张绪超教授

广东省肺癌研究所所长、中心实验室主任、中国临床肿瘤学会（CSCO）理事会常务理事、CSCO肿瘤生物标志物专家委员会秘书、广东省转化医学会肿瘤学分会主任委员、广东省抗癌协会肺癌专业委员会常委、广东省抗癌协会靶向与个体化治疗专业委员会副主任委员、广东省抗癌协会分子诊断委员会副主任委员、广东省药理学会肿瘤药理专业委员会副主任委员

测序中国：液体活检是目前精准医学发展最快的领域，包括CTC、ctDNA、外泌体，目前CTC和ctDNA已经在肺癌精准治疗领域应用比较成熟，深刻的改变了临床实践，推动医学发展。做为三驾马车之一，外泌体虽然研究逐步增多，但是比较集中基础研究，临床试验虽然也逐步开展，可能还走在转化的路上，您如何看待这种基础研究和临床转化的关系？

张绪超教授：在肿瘤学临床实践和研究中，液体活检技术已经被广泛应用，并在技术上处于快速发展过程中。采用cfDNA、CTC两种生物材料已经积累了较多的证据，在晚期肿瘤中得到了临床推广和应用，特别是来自血浆的cfDNA，被用于分子诊断、疾病或微小残留病监测、靶向治疗耐药机制分析、甚至是疾病早期检测。采用这些生物材料，患者血浆中的另一种重要生物材料外泌体也正得到加强研究。肿瘤患者的外泌体是一种细胞分泌的微囊泡结构，其中携带了DNA、RNA、蛋白质等肿瘤相关信息成分。因而，理论上能够从外泌体中检测到DNA序列变异、RNA的表达变化、蛋白质变化等。由于存在外泌体分离技术、分离量、及检测技术的挑战，外泌体在肿瘤学中的应用还需要加强和深入研究。特别是应该做好基础研究和转化应用的衔接，即围绕上述挑战性的技术难题，如何将实验室的工作成果转化到的临床场景的成功应用。

测序中国：您对外泌体的转化前景如何看待？是否有可能进入到临床实践中？

张绪超教授:总的来看，外泌体在临床肿瘤学和其他学科中的转化应用前景良好。外泌体携带了DNA、RNA和蛋白质因子等信息。这些分子有潜力能够帮助判断肿瘤的发生、靶点分子分型、预后判断、靶向治疗耐药机制、PDL1表达水平、残留疾病监测等。在未来，是否能够进入主要取决于临床转化应用研究的成果和证据级别。如果能够解决外泌体的特异性分离，并在达到一定分离产量的基础上，采用NGS/免疫细胞化学等技术稳定监测到靶点基因突变、PDL1或HER2等蛋白表达水平，结合干预性临床队列分析能够给患者带来精准诊断和有效指导用药的好处，那么外泌体就可能会得到真正的临床实践应用。

测序中国：在2016年第十三届肺癌高峰论坛——液体活检：规范与精准同行形成的专家共识中，提到液体活检包括血液循环肿瘤细胞、血浆游离DNA和外泌体。外泌体已经进入到临床专家的视野中。您认为外泌体真正走到临床应用中应该需要大家做出哪些努力？

张绪超教授：在2016年的第十三届肺癌高峰论坛专家形成的共识中，外泌体已经被纳入作为临床转化研究的主要内容之一。但在今天来看，外泌体的临床研究证据尚处于低级别的证据水平。所以，在当前和未来，需要大家多方努力，共同协作，才可能将外泌体应用真正推向临床。这些努力需要包括以下几点：（1）在外泌体的材料获得方面，应该结合分析技术的敏感性，优化外泌体的分离技术，提高外泌体产量，并使之标准化。处于分析流程上游的外泌体分析相关试剂盒和耗材的研发很重要。（2）分析技术方面，应该结合临床应用目的，提高分析性能，提高临床分析敏感性和特异性。利用外泌体分析的分子标志物内容可能包括DNA变异、RNA表达变化、蛋白质表达变化等。临床分子标志物的分析准确性需要研究来验证，譬如采用外泌体分析EGFR、KRAS、ALK、ROS1、HER2、NTRK、MET、RET、BRAF等靶点基因变异时，和利用肿瘤组织及血浆游离DNA进行比较，基于外泌体分析的准确性是否达到非劣效水平是判断临床应用价值的重要依据。（3）需要结合临床队列，设计合理的队列研究，来证实外泌体的临床场景下应用能够给患者带来有效指导靶向用药、预后预测，甚至是早期疾病检测或微小残留病分析等。总之，在上述各个环节都需要获得高质量可信的研究成果的基础上，外泌体才能真正应用于临床给患者带来获益。

第三军医大学大坪医院心血管病专科医院-曾春雨教授

第三军医大学大坪医院心血管病专科医院院长、重庆市心血管病研究所所长、心血管内科主任、长江学者特聘教授、国家杰出青年科学基金获得者、国家中青年科技创新领军人才、国家“万人计划”领军人才、国家重点研发计划首席科学家、973项目首席科学家、美国Clin Exp Hypertens杂志副主编、Hypertension等10余种SCI杂志编委、重庆市医学会心血管病专业委员会主任委员。

测序中国：能否介绍一下您在心血管领域的工作情况？

曾春雨教授：EVs研究领域非常宽泛，包括EVs的来源、靶向、与受体细胞的融合过程，也包括EVs本身的分泌、构成、内容物的成分，作为标志物和治疗手段的应用前景等等问题。我们前期针对EVs中的一些问题做了一点点的工作。如：在EVs的构成方面，我们发现EVs中除蛋白、mRNA外，还存在DNA片段，某些DNA片段具有完整的结构，可以在转入受体细胞后发挥作用，如：EVs中的AT1受体基因、SRY 基因等（Clin Sci, 2015;129:259；J Mol Cell Biol. 2013;5:227）。在EVs作用方面，我们发现间充质干细胞EVs中miR-210可以通过影响Efn3基因促进心梗后微血管的形成，从而保护心功能（Biochim Biophys Acta - Mol Bas Dis.2017;1863:2085）;细菌感染后LPS刺激单核细胞释放富含miR-27a的EVs，通过作用于血管内皮，损伤Mas受体功能，发挥升高血压的作用（Am J Hypertens 2020;33:31）。在诊断方面，我们发现 EVs中的长链非编码RNA，CoroMarker,可以用于诊断动脉硬化性疾病（Clin Sci. 2015;129:675；Cardiovasc Res 2016;112:714）。

测序中国：外泌体在心血管领域的研究和应用现状如何？

曾春雨教授：EV携带蛋白质、RNA和/或microRNAs（miRNAs）等分子，在细胞间通讯中起着载体的作用。大量证据表明，EVs参与许多生理和病理性心血管过程，包括血管生成、血压调节、心肌细胞肥大，以及心肌纤维化。由于EV普遍存在于血液和尿液等体液中，EV已被用作心血管疾病的潜在生物标志物。此外，由于EVs是干细胞旁分泌效应的重要组成部分，EVs作为干细胞治疗替代方案得到人们的重视。临床前研究已显示了EVs在保护心肌缺血损伤以及促血管生成等方面的治疗潜力。

现在用于心血管疾病治疗的EVs 包括间充质干细胞和造血祖细胞或干细胞（CD34+细胞），这些EVs应用促进心肌梗死（MI）后的心脏修复。随着EVs的应用，人们还尝试对EVs进行生物工程化改造，具体目标包括调节EVs释放、提高其生物活性、稳定性、靶向性和向心血管系统转送（通过开发EVs运载系统）等技术。如：靶向技术可以增加EVs在心血管系统中的积累，从而减少所需的剂量。

测序中国：外泌体研究和转化如火如荼，美国exosome dx公司开发的尿液外泌体诊断产品EPI已经纳入医保并进入FDA绿色通道；codiak公司2020在纳斯达克上市，通过工程化外泌体治疗癌症和罕见病，很多国际制药巨头也纷纷投入这个领域来，您如何看待这种现象？

曾春雨教授：EV是一个非常宽泛的概念，不仅因为来源不同，功能不同；即使在同一机体同一细胞，不同的状态下分泌的EVs差别也很大，因此，如何实现EVs的标准化一直是大家关心的问题。此外，EVs在机体的稳定性、靶向性也是困惑大家的关键细节，但这些细节又决定了EVs治疗的成败。codiak公司通过工程化外泌体治疗癌症和罕见病为人们在这方面的努力提供了有益的借鉴，相信随着材料学、药物学、工程学等加入EVs转化研究队伍中，必将为EVs临床应用添加助力。

北京恩泽康泰CEO-孔关义

中国医药质量管理协会临床试验及大数据质量管理分会青年委员。毕业于武汉大学，生物信息领域资深应用专家。先后在诺禾致源、菲沙基因、百迈客工作，曾担任生物信息总监和医学事业部总监。主导和参与的科研合作项目成果发表在Science，Nature biotechnology ，Nature communication，JEV等杂志上。申请发明专利20余项及多项软件著作权。2017年创立恩泽康泰，领导恩泽康泰成为外泌体临床转化领域的领跑者。

测序中国：外泌体分离和使用的技术一直是行业难点，作为国内首家致力于外泌体技术开发与临床转化的创新型高科技公司，您是如何解决这一难点的？

恩泽康泰CEO孔关义：科学研究领域基于超离的差速离心和梯度密度离心应用较为广泛，但是其受到本身设备通量及可标准化程度的影响，并不能满足临床转化的需求。要解决外泌体的分离，首先要解决外泌体分离质量（包括纯度、得率及活性等方面）的评估，然后才是技术路线的选择。我们在这两个方面做了非常深度的研究和比较，形成了外泌体分离方法及质控方法等一系列的专利，目前多数已经获得授权，也发表了相关的方法学论文，并且基于自主知识产权开发了Exosupur试剂盒（SEC原理）主要用于大批量临床样本的分离，有效解决了通量和重复性的问题。针对外泌体的治疗应用则需要解决大体积起始样本的外泌体分离，基于自主技术与工业化供应商的合作，结合国际外泌体治疗领域的工业化进展，我们形成了一套切向流+层析的分离体系能够有效的解决大体积的外泌体分离，并且有效保障外泌体的纯度和得率。

测序中国：作为外泌体顶级期刊JEV发表研究文章的公司，您如何看待科研服务和临床业务的关系？

恩泽康泰CEO孔关义：外泌体临床应用前景广阔，已经在一些领域有了明确应用场景，但是还有更多的应用潜力有待挖掘。外泌体更多应用场景的挖掘离不开外泌体基础科研及临床研究的突破，外泌体的基础研究能够发现更多的潜在治疗靶点和生物标志物，而临床的研究能够对治疗靶点及标志物进行有效的验证。高质量的科研服务能够有效的促进外泌体基础研究和临床研究的进展，挖掘更多的潜在应用场景，并结合临床研究推动外泌体应用的临床进展，有效促进临床转化。因而，科研服务能够有效的促进临床转化业务，同时也能够让企业保持敏锐的嗅觉，时刻关注外泌体领域基础和临床研究的进展。基于此，我们发起了E100计划，以疾病的临床诊断和治疗为切入点，依托特有的外泌体技术和多维度检测及功能机制研究平台，与国内相关领域的临床专家合作，以系统性的筛选、发现、建立、验证一系列可用于疾病诊断和治疗的单个或多个标志物分子，进一步在体内、体外层面对目的分子的功能机制进行研究探索，最后通过大量不同肿瘤、不同疾病的系统性研究，建立基于大样本量的具有统计学意义的临床应用评价，最终建立可用于疾病临床诊断、预后评估和治疗相关的外泌体医学数据库，助力临床精准治疗。

测序中国：目前这个细分领域快速发展，企业在推动行业发展中如何做出贡献？

恩泽康泰CEO孔关义：外泌体领域快速发展，整个产业还处于早期阶段，企业规模还不大，这是国内行业的现状。对于企业在推动行业发展如何贡献力量可以有以下五个方面：首先，企业要能够坚守正确的价值观，提供高质量的产品和服务，为客户创造正向的价值，我们核心价值观的第一个就是“专业严谨”，这是我们立志于做临床科研首选合作伙伴的根本；其次，企业要投入到外泌体临床应用关键技术问题的解决上，以技术出发推动应用的进展，比如我们针对外泌体微量特征开发了外泌体UMIRTM建库技术，针对外泌体RNA独特性建立了严格的六步质控法；再次，企业保持开放，开展与基础及临床专家的合作，促进外泌体基础科学和临床的突破；然后，企业要建立高要求的内部质量标准，并与行业协会合作共同推动行业标准的建立，推动行业有序发展，比如我们公司CTO赵立波博士积极参与执笔了国内首个外泌体专家共识—《外泌体研究、转化和临床应用专家共识》；最后，企业还应起到正确的行业知识教育和传播的作用，让更多的人关注并理解外泌体这个行业，比如3月6日我们与CSEV、医药加联合主办的共识与实践 探索与挑战2021外泌体临床应用难点与行业展望学术沙龙会议。以上这五个方面，也是恩泽康泰一直在努力的方向。