2023年外泌体行业研究报告

 

1.1  递送系统的演变

 

随着治疗方式从“小分子”扩展到包括“核酸”、“多肽”、“蛋白质”、“抗体”、“核酸”、“活细胞”，活性物质的递送和吸收能力成为了新的挑战。

图2. 治疗方式的演变

现代药物递送技术始于1952年，诞生了Spansule (缓释胶囊)技术，到20世纪80年代，口服和透皮制剂为小分子药物提供了长达24小时的治疗持续时间，并主导了药物递送领域和市场；1989年，基于Lupron Depot (PLGA聚合物)的批准为长效注射剂和植入剂打开了大门，并出现递送各种小分子、多肽、蛋白质的系统的百花争艳；1990年第一个Adagen (PEG化蛋白)的问世标志着聚乙二醇化药物的新纪元，在过去的30年里已开发约20种聚乙二醇化蛋白药物，该技术从1995年的Doxil (PEG化脂质体)批准开始在纳米制剂中应用，在2018年批准了siRNA药物如Onpattro (PEG化LNP)、2021年批准了mRNA药物如Comiranty (PEG化LNP)；2000年，美国政府推出了“国家纳米技术倡议”(NNI) ，被称为“纳米医学”，Mylotarg (ADC)、Doxil (PEG化脂质体)、Abraxane (白蛋白-紫杉醇复合物)成为纳米医学的典型代表；药物-聚合物复合物和偶联物中的ADC至今备受关注，2009年第一个抗体-药物偶联物Mylotarg (ADC)获批；2018年Onpattro (LNP)的获批打开了LNP递送系统的广泛应用，众多创业公司进入该领域，但还需要进一步的发展，如“内体逃逸”以实现胞质溶胶等；2017年首个眼科AAV基因递送药物Luxturna (AAV)上市，AAV等病毒递送系统进入了爆发期；2021年，exoIL-12(Exosome, 外泌体）率先进入人体临床试验，标志着外泌体递送系统进入了产业化的征途，虽然该产品由于某些原因暂停，但后起之秀ExoFlo™(Exosome, 外泌体)外泌体药物已处于临床III期，外泌体作为活性物质的递送系统将开启纳米医学和细胞与基因治疗的新篇章。

图3. 递送系统的演变

外泌体递送系统不同于传统递送系统，包含天然外泌体和工程化外泌体：

天然外泌体内部包裹了多种调节蛋白、microRNA和mRNA等天然活性物质，具有优异的治疗和美容效果，作为细胞治疗的“无细胞疗法”的重要手段。1）在医美护肤领域：ExoCoBio的干细胞外泌体已经于2018年上市销售，是世界首创将源于干细胞培养液的外泌体（ASC-EXOSOME™）成分冷冻干燥制成的产品，以具卓越的肌肤再生及抗炎效果为主要产品特征；国内“天津外泌体科技”的Y3系列美容产品已经获得欧洲的CE认证，可在欧盟进行大规模销售。2）在治疗药物领域：干细胞天然外泌体药物ExoFlo™中发现了多种蛋白和核酸物质，可替代干细胞治疗，处于美国III期临床试验；CAR-T细胞来源的EVs表达高水平的穿孔素和颗粒酶B以及CAR，有效地杀伤实体肿瘤。

表1 外泌体药物ExoFlo™中发现的调节蛋白

1.2  外泌体结构及形成

外泌体(Exosome)是几乎所有细胞均可释放的、直径约30-150 nm的细胞外囊泡(Extracellular vesicle, EV)，由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中。

EV可分为Exosome (外泌体, 30-150 nm)、Ectosome (核外颗粒体, 100-1000 nm)、Apoptotic bodies(凋亡小体, 50-5000 nm)三大类。Exosome由胞吐作用(exocytosis)释放，Ectosome由质膜向外出芽(Outward budding)而分泌，Apoptotic bodies在凋亡后期由程序性死亡细胞释放（图4）。

图4. 细胞外囊泡亚型示意图

(Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 170)

在经典分泌途径中，带有蛋白质货物如胞外蛋白的囊泡在高尔基体（GOLGI）中分拣和包装，将其货物运输到质膜（PM），通过与质膜融合，膜蛋白和分泌蛋白都被有效地运输到它们预定的目的地（图5）。

各种类型的货物，如蛋白质、RNA等，也可以通过质膜向外出芽形成脱落的囊泡（核外颗粒体, Ectosome）方式运输到细胞外空间。货物通过细胞内吞作用（受体介导和自由摄取）摄取，形成初级内体（EE）。在初级内体（EE）中，货物要么被回收到质膜（PM），要么被封闭在多泡体（MVBs）的腔内囊泡（ILV，外泌体前体）中（图5）。

外泌体（Exosome）的形成始于初级内体（EE）的膜向内出芽，随后形成多泡体（MVBs）。在胞吐途径①中，多泡体（MVBs）与质膜（PM）融合，将其内容物（外泌体，Exosomes）释放到细胞外空间，外泌体货物运送到受体细胞可以通过直接与受体细胞膜融合（Membrane fusion），胞饮作用/吞噬作用（Pino- or phagocytosis），或配体-受体结合（Receptor binding）等各种机制发生；在降解途径②中，多泡体（MVBs）被运送到溶酶体（LS）进行酶辅助降解。这一途径对于抑制激活的生长因子受体的信号传导尤为重要（图5）。

图5. 不同类型EV形成通路

Extracellular protein-胞外蛋白；Receptor-受体；Cargo-货物: 蛋白、RNA等；Regular protein export/secretion-调控蛋白运输/分泌；Intraluminal vesicle (ILVs)-腔内小囊泡；Exosome-外泌体；Shed vesicle/Ectosome-核外颗粒体；PM-质膜；ER-内质网；EE-初级内体；LE-次级内体；LS-溶酶体；MVB-多泡体；GOLGI-高尔基体；NUCLEUS-细胞核；Exocytic pathway-胞吐途径；Degradative pathway-降解途径；(Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 170)

在外泌体的生成过程中，有几种蛋白密切参与，包括Rab GTPases、ESCRT蛋白，以及被用作外泌体标记的CD9、CD81、CD63、flotilin、TSG101、神经酰胺和Alix等。不同来源的细胞生成外泌体的速率、大小、组分(货物)均有异质性。外泌体腔内组分主要由mRNA、miRNA、gDNA片段、以及无数不同的蛋白质组成，这些组分类型取决于细胞的起源（图6）。

外泌体作为细胞间物质交流和信号传递的途径，不同细胞间通过分泌携带有不同组分的外泌体实现通讯，这些分泌的外泌体被受体细胞吸收，通过释放内含物实现物质和信号的交流（图5）。

1.3  天然外泌体

 

几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。根据不同生物来源分类，外泌体分为动物细胞外泌体、植物外泌体、微生物外泌体。

哺乳动物细胞外泌体由几乎所有类型的“健康细胞”和“病理细胞”分泌，存在于不同的体液中，例如血浆、尿液、乳汁、唾液、羊膜、细支气管肺泡、滑膜以及腹水等。在循环外泌体中，80-90%来自血小板、淋巴细胞、树突状细胞、其他免疫细胞，通过循环系统到达其他细胞与组织产生远程调控作用。正是基于此，外泌体天然具有活性物质的递送功能(天然递送系统)和作为疾病的特异性生物标记物(诊断标志物)。

目前可通过GMP大规模生产获得动物细胞外泌体的主要包括：牛奶外泌体、人心脏祖细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体、脂肪干细胞外泌体、树突状细胞外泌体、HEK293细胞外泌体。

植物外泌体（plant exosome）的形成区域通常始于反式高尔基体或者早期内体，随后形成多囊泡内体（MVEs）或者多泡体（MVBS），并选择性地将mRNA、miRNA、其他非编码RNA等多种RNA、脂质、DNA等结合进囊泡中，最终植物外泌体与质膜结合将内含物释放。植物外泌体体积小、组织穿透性强，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，成为经皮递送、靶向给药、基因传递等递送理想载体。

目前，公开报道的植物外泌体研究包括葡萄外泌体、生姜外泌体、芦荟外泌体、人参外泌体、金银花外泌体、甘草外泌体、红景天外泌体、西兰花外泌体、葡萄柚外泌体、小麦外泌体、大蒜外泌体、蒲公英外泌体、洋葱外泌体等。研究发现，植物外泌体蕴含了植物中90%的活性成分，是植物有效成分浓缩的精华中的精华。1kg植物仅能提取1μg植物外泌体，而其活性却远高于1kg植物提取物。

植物外泌体含有较为丰富的miRNA，为一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA，来自药用植物外泌体的miRNA可能作为新的生物活性成分与哺乳动物系统相互作用，外泌体作为中药活性成分的应用将越来越广泛。

微生物外泌体的研究主要集中在细菌胞外囊泡(BEVs) ，其发现可追溯到20世纪60年代。BEVs类型多种多样，根据产生方式不同包括：革兰氏阴性细菌来源的外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)、古菌和革兰氏阳性细菌来源的细胞质膜囊泡(cytoplasmic membrane vesicles，CMVs)、外-内膜囊泡(outer-inner membrane vesicles，OIMVs)、破裂性外膜囊泡(explosive outer membrane vesicles，EOMVs)。

BEVs直径范围为20-400 nm，影响多种生物过程，包括毒力因子的运输、DNA转移、噬菌体的拦截、抗生素和真核宿主防御因子、细胞解毒、细胞代谢物输出、细胞间通讯等。

BEVs与哺乳动物宿主细胞的相互作用多集中在肠道微生物菌群。肠道菌群积极促进肠道和远端器官的基本功能。在肠道生态系统中，微生物群与宿主之间的双向通讯不涉及直接的细胞接触。越来越多的证据表明，细菌分泌的BEVs通过向宿主细胞运输和传递调节宿主信号通路和细胞过程的效应分子来介导菌群功能，肠道微生物群释放的BEVs可能对健康和疾病有很大的影响。BEVs可能作为预防肠道感染或炎症和免疫相关疾病的治疗、营养策略，使用分离的BEVs将可能克服在免疫缺陷个体中使用活益生菌的潜在风险。肠道微生物群组成和多样性的失衡与包括癌症、神经、代谢和免疫紊乱在内的多种疾病有关，在患者和健康人群的血液和尿液样本中发现了肠道微生物群来源的BEVs，其特征与肠道微生物组高度相关，这为诊断提供了新的策略。

1.4  工程化外泌体

为了拓展其作为纳米递送系统的可能性，科学家通过生物工程、化学工程策略来设计并装载“工程化外泌体”，开发出了基于工程化外泌体的“纳米递送系统”。生物工程 (Biological Engineering)通过膜结合蛋白的遗传融合引入靶向基序，如多肽、蛋白、ASO等，代表企业有Codiak、Evox、唯思尔康、恩泽康泰等。化学工程 (Chemical Engineering)指通过“脂类化学反应”或“膜结合蛋白化学反应”或“脂质-脂质相互作用”安装不同的片段，如抗体、蛋白、适配体、小分子、聚合物等，代表企业有天津外泌体科技等。