干细胞外泌体源头供货

实验有效证明“干细胞的归巢作用不会受限于治疗方式”(局部或全身性)

许多临床研究或临床试验表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSc)可以治疗多种疾病,特别是一些复杂疾病,但疗效不同。研究人员开始反思:为什么具有治疗功能的间充质干细胞在临床疗效上有很大差异?对于这个问题,不同的研究者有不同的思考和解释。

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首先,我们应该意识到,间充质干细胞(MSc)与化学药物有着明显的区别:(包括但不限于)
 ①化学药物是死的,而MSC是有生命的;
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 ②化学药物有明确的半衰期,MSC暂时没发现;
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③化学药物有明确的单一靶位点,MSC通过多途径发挥作用;
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④化学药物在体内都是被动运输,MSC具有主动趋化迁移的功能特性;
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⑤化学药物的均一性非常好,MSC的均一性很差,细胞周期的步伐并不十分一致。
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这些差异给临床治疗带来了什么思考?在临床研究或应用中,研究者习惯性地基于化学药物的思维来治疗细胞是否合适?

大量实验数据表明,间充质干细胞进入人体后,不会在体内停留很长时间,随着时间的延长,会被机体清除。这也解释了间充质干细胞的机制不是向组织特异性成熟细胞分化。

动物实验表明:免疫系统健全的机体,其清除输入体内MSC的速率越快。局部注射、外周静脉注射和动脉注射对MSc在体存活时间均有较大影响。

局部注射

Local injection

MSC最常见的局部注射部位是脑、肢体肌肉、心脏、肝脏和腰椎(蛛网膜下腔)

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将人骨髓间充质干细胞局部注射到大鼠纹状体后,72天后仍能检测到人骨髓间充质干细胞的存在,并能迁移到胼胝体和大脑皮层。将MSC局部注射到右尾状核后,4周后可在脑内多个部位检测到MSC的存在,并发现MSC在脑内迁移,更倾向于遵循血管的方向。

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然而,颈动脉注射后MSc在脑内的存活时间一般为1-2天[3-5]。24小时后,磁共振成像(MRI)显示MSC可以穿过血脑屏障,迁移到大脑皮层、皮质下白质层、纹状体、脑干,甚至到对侧大脑。将人骨髓间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞分别注入大鼠颈动脉。发现人骨髓间充质干细胞的清除率比大鼠骨髓间充质干细胞快,说明异种细胞的清除率更快[3]。

TNF-α和IL-1β首先刺激MSc(24h),然后将MSc注入左心室。与对照组相比,TNF-α和IL-1β刺激后,MSC趋化和向心肌缺血区迁移的数量显著增加,说明TNF-α和IL-1β可增强MSC的粘附能力,但VCAM-1单克隆抗体可阻断这种作用。

全身注射

Systemic injection

将MSC腹腔注射到免疫缺陷小鼠(裸鼠和NOD/SCID小鼠)体内后,MSC可在多种组织和器官中存活120天。然而,MSC只能在免疫系统健全的不同种小鼠中存在20天以上,而在同一种小鼠中可以存在40天以上(见图)。

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大鼠颈静脉灌注人MSC 1h后,大鼠体内检测到的人MSC数量减少到82%左右,8d后仅检测到0.06%,主要分布在肺、肝、脾等组织中,少数分布在肾、小肠和睾丸。随着时间的推移(2天至8天),睾丸中MSc的含量略有增加(4.6%至9.3%,黑柱)(见下图,图中百分比是指体内可检测到的细胞数,而不是输入的细胞总数)。

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▲人MSC大鼠颈静脉输入

但在1940年以前,人均寿命并不符合这一规律。如上图1所示,在1940年之前的90年中(橄榄绿曲线下的曲线),出生时的预期寿命比儿童时期估计的要短。这一悖论在图2中更为清晰:19世纪中后期,出生时的预期寿命甚至比青春期的预期寿命还要短。

狒狒实验表明,骨髓间充质干细胞经外周静脉输注体内后,自体和异体间充质干细胞在体内的分布无明显差异。脐血来源的MSCs比骨髓MSCs更容易通过肺部,供体年龄越大,骨髓MSCs越容易滞留在肺部;滞留在肺部的MSC细胞数量与MSC细胞表面表达的整合素α4和α6密切相关,且表达水平越高是的,它留在肺里的可能性就越小。

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外周静脉输注MSC后,大部分MSC留在肺内,随血流到达肝、肾、脾。虽然MSCs分布于全肺,但有研究表明右肺MSCs的数量多于左肺,也有研究表明左肺MSCs的数量多于右肺。

MSC注射后1小时,50-60%的MSC留在肺内。3小时后降至30%,维持96小时。在肺损伤的情况下,MSc在肺中的滞留增加,甚至高达83%。虽然外周静脉MSCs大多滞留在肺部并被清除,但MSCs可被肺部局部微环境激活,分泌大量抗炎因子TSG-6,有利于减轻炎症,减少心肌梗死缺血面积

失代偿期肝硬化患者自体骨髓间充质干细胞体外扩增后,外周静脉输注111In-oxine(放射性示踪元素)标记的间充质干细胞。在不同时间点检测标记的MSCs。结果显示,随着时间的延长,肺内滞留的MSCs数量逐渐减少,而肝、脾内的MSCs数量逐渐增多,脾内积聚的细胞数量多于肝内(见下图)

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▲输注MSC后肺脾肝细胞数对比

实验证明,外周静脉MSCs可向四肢骨髓迁移,但经血管扩张剂治疗后,向骨髓迁移的MSCs数量增加了50%。骨髓间充质干细胞向骨髓迁移的最长时间为76天。然而,体外培养12代以上的MSCs以及老年供者来源的MSCs向骨髓的迁移能力明显下降;骨髓辐射损伤后,向损伤骨髓迁移的MSCs数量增加。静脉注射的MSCs也能向脊髓内迁移,为周围静脉MSCs治疗脊髓损伤提供了实验依据。

不同途径比较

compare

为建立猪心肌梗死模型,采用外周静脉、冠状动脉和心内膜三种不同方法输注骨髓间充质干细胞。14d后检测心肌梗死部位MSCs数量。结果表明,冠状动脉注射MSC的治疗效果最好,向缺血区迁移的MSCs最多,其次是心内膜注射,缺血区无法检测到,即使局部注射后,仍有约10%的MSCs进入循环系统并向肺迁移还有肝脏。

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建立骨关节炎(OA)和关节炎(arthritis)小鼠模型,给予尾静脉注射人脂肪源性MSc(adipose-derived stem cells),10天后小鼠体内尚未检测到人脂肪源性MSc;但给予关节内注射人脂肪源性MSc,10天后仍存在这一数据表明,全身静脉输注MSC在体内的注射速度比局部注射快

颈外动脉注射MSCs后10d,大脑皮质仍可见MSCs,通过血脑屏障的MSCs可向对侧脑迁移,但脑内未见外周静脉MSCs。

主动趋化迁移

Chemotactic migration

MSc细胞表达大量趋化因子受体,能敏感地感知和结合体内的趋化因子,并沿趋化因子浓度梯度由低浓度向高浓度迁移。损伤组织释放出的P物质在体内形成浓度梯度,可以吸引MSC沿着浓度梯度迁移到损伤部位进行修复;即使静脉注射P物质也可以动员体内MSC进入循环,迁移到损伤部位,从而促进损伤部位的修复损伤组织[27]。心肌受损,损伤部位释放趋化因子,吸引静脉内MSC迁移至损伤部位心肌组织达7天。

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MSc具有很强的穿透血管的能力,这种能力不受血管通透性的影响,这在动物实验中得到了很好的证明。如建立小鼠皮肤炎症模型,给予MSC静脉注射,观察到约47.8%的MSC在2小时后通过血管壁进入肌肉组织。

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▲MSC穿透血管的示意图

结语

epilogue

不同实验中MSc的时间有显著性差异。如果是外周静脉输注,MSc在体内的分布比较一致,首先在肺内汇聚,少量的MSc可以通过肺到达肝、脾、肾、胰腺等血液丰富的器官,还有少量可以迁移到骨髓。

从目前的研究成果来看,无论是局部注射还是全身注射,无论是自体MSC还是异体MSC,体内都会逐渐清除MSC。去除率与机体免疫系统、输入方式、细胞来源组织、细胞供体年龄、细胞体外培养时间长短等因素有关。单次MSc输入的影响并不持久。

由于MSC具有趋化性和向损伤部位迁移的特点,MSC在健康体和损伤体中的分布略有不同;MSC不能识别损伤类型(如急慢性损伤、出血性损伤或缺血性损伤等),如果体内存在多发性损伤,损伤细胞的数量也会增加MSC对各损伤部位的趋化性降低。

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