皮肤上皮干细胞分化的基本机制

皮肤是保护身体免受脱水、受伤和感染的第一道防线。为了满足这些需求，皮肤进化出了一个复杂的分化过程，形成了坚韧、不透水的外壳，并且可以不断更新。哺乳动物的皮肤由真皮和表皮成分组成；本次讨论仅限于表皮细胞，即角质形成细胞。哺乳动物表皮是分层组织，固定在基底膜上（图 1A）。直接接触基底膜的细胞层，称为基底层，含有增殖细胞。与所有角质形成细胞一样，基底层细胞拥有 10 nm 角蛋白中间丝 (IF) 网络，但它们在其他方面相对未分化。随着基底细胞的数量因分裂而扩大，一些细胞从基底膜上脱离并开始向外移向皮肤表面。发生的第一个变化是加强 IF 网络以增加每个单元格的抗拉强度。细胞通过合成大量新的角蛋白组来实现这一点，这些角蛋白组装成 IF，这些 IF 聚集成更有弹性的束或 IF 缆。IF 电缆固定在称为桥粒的细胞-细胞连接处，因此不会将力分布在单个细胞上，而是分布在整个组织上（参见参考文献 1）。当现在由桥粒连接的基底上细胞向皮肤表面串联移动时，它们在质膜下沉积并酶促交联蛋白质以形成角化包膜。这些细胞还制造充满脂质的层状颗粒，这些颗粒被挤压到角质化的包膜支架上，提供不透水的密封，防止液体不受控制地逸出 (2)。所有材料的生产完成后，细胞停止转录和代谢活动并经历程序性细胞死亡，这与细胞凋亡有一些相似之处 (3)。从皮肤表面脱落的细胞（鳞屑）主要由死蛋白质囊组成；这些细胞残余不断地被向外移动的内部细胞所取代。

(A) 皮肤上皮组织学的图示。基底层的细胞附着在下面的基底膜上。基底细胞具有有丝分裂活性，但当它们脱离基底膜并开始向皮肤表面外行时，它们就失去了这种潜力。当基底细胞进入棘层时，它们加强了细胞骨架和细胞间的连接，获得了对机械应力的弹性。一旦这个任务完成，细胞就会进入颗粒层，在那里它们产生表皮屏障。屏障前体由两个主要成分组成：(i) 富含谷氨酰胺和赖氨酸的角化包膜前体蛋白，它们在质膜下合成并沉积，以及 (ii) 充满脂质双层的层状颗粒。当细胞进入终末分化的最后阶段时，钙流激活转谷氨酰胺酶，该酶通过 ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键以生物化学方式交联角质化包膜蛋白，并激活脂质双层挤压到 这个脚手架。细胞死亡随之而来，在皮肤表面留下死去的扁平鳞屑，这是终末分化的最终过程。这些角质层鳞片最终从皮肤表面脱落，由向外移动的内层细胞不断补充。(B) 表皮增殖单位图。假定的慢循环表皮干细胞偶尔会分裂，产生干细胞子细胞和瞬时扩增子细胞。瞬时扩增细胞分裂 2 到 4 次，然后这些后代离开基底层并执行终末分化程序。该模型基于将 β-半乳糖苷酶基因逆转录病毒转导到培养的角质形成细胞中，然后将其用于移植到裸鼠上以追踪干细胞谱系 (9)。

在小鼠皮肤中，通过放射自显影测量，从基底层到鳞屑的整个分化过程需要 10-14 天 (4)。人的表皮更新更慢；然而，人类皮肤上皮干细胞的增殖储备一定是巨大的，其后代足以维持 1-2 平方米的皮肤数十年。

皮肤生物学领域的早期观察是表皮角质形成细胞可以在培养物中生长。与需要转化才能有效培养的许多其他细胞类型相反，直接取自皮肤的上皮细胞在存在成纤维细胞饲养层 (5) 的情况下培养时可以传代多代。当在表皮生长因子 (EGF) 受体配体如 EGF 或转化生长因子 α (TGFα) 存在的情况下生长时，人角质形成细胞可以扩增 1016 倍 (6)。对人类皮肤角质形成细胞生长潜力的仔细分析揭示了三种不同类型的细胞，基于它们能够在单次铺板中产生的克隆大小 (7)。具有最大增殖潜力的全克隆包含几乎所有 (95%) 的细胞在传代时继续形成增殖集落。Meroclones 具有中等增殖潜力，而 paraclones 在很少传代后就会中止和分化。全克隆细胞可以转变为 meroclone 和 paraclone 细胞，但在本研究中未观察到反向转变。很容易推测体外产生全克隆细胞的细胞可能是体内的干细胞。

在哺乳动物皮肤的初始组织学评估中，干细胞可能所在的基底层没有明显的形态学上不同的区域或生态位。从 1970 年代就知道，表皮被组织成熟细胞层列 ≈ 10 个细胞宽（见图 1B）(8)。最初假设整个基底层由干细胞组成，后来假设朗格汉斯细胞是干细胞。辐射剂量-存活研究表明，干细胞可能占基底层细胞的 2-7%（参见参考文献 8）。一种回顾性地证明表皮培养物中存在干细胞的方法是标记细胞群，然后使用它们在体内重建表皮组织。因此，当将表达 β-半乳糖苷酶报告基因的逆转录病毒标记的鼠表皮培养物移植到小鼠身上时，重建的皮肤在宿主动物中显示出表达 β-半乳糖苷酶的表皮细胞的克隆柱（图 1B）（9）。12 周研究期间细胞柱的大小表明，多达 10-12% 的小鼠基底层细胞可能是能够产生单个成熟细胞柱的“干细胞”。

另一种识别组织干细胞的方法利用了它们缓慢循环的特性。在脉冲追踪实验中，组织的所有分裂细胞都将溴脱氧尿苷 (BrdUrd) 或氚化 [3H] 胸苷等核苷酸类似物掺入新合成的 DNA 中。当标记被追踪时，只有那些很少分裂并且随着时间的推移仍然存在于组织中的细胞才会保留它们的标记。在口腔上皮细胞中，所谓的标记保留细胞或 LRC 位于舌头和腭乳头的离散区域 (10)；在鼠耳表皮中，LRC 位于基底层，靠近分化细胞柱的外围 (11)。因此，在 1980 年代出现了一种皮肤上皮维护模型，其中基底层中缓慢循环的干细胞的周期性分裂导致瞬时扩增细胞占据大部分基底层，分裂 2 或 3 次，然后向上移动同时分化成成熟的皮肤细胞（图 1B）。

在 1990 年代，研究人员使用 [3H] 胸苷评估小鼠毛发表皮中的标记保留，发现皮肤中的大部分 LRC 位于毛囊的“凸起”区域，只有一小部分 LRC 位于基底层滤泡间表皮 (12, 13)。毛囊是一种表皮附属物，由上部永久性部分和下部循环部分组成，可产生毛发（图 2；参见参考文献 14 和 15）。外根鞘 (ORS) 与表皮的基底层相邻并且生化相似。毛囊的内层包括三个同心层的内根鞘 (IRS) 和三个同心层的生毛细胞。毛囊底部是萌发基质，其中包含快速增殖的“基质”细胞，这些细胞分化以填充 IRS 的所有层和毛干本身。包含 LRC 的毛囊隆起位于 ORS 内皮脂腺正下方的小壁龛中，在竖毛肌插入部位或附近。乍一看，凸起是干细胞生存的有趣地方；它位于皮肤表面下方，受到毛囊上部的一列细胞以及高度角质化的毛干本身的保护。穿过基底膜，它被一个支持性真皮袋包围，该真皮袋具有丰富的血管化和神经支配。

由表皮干细胞提供的毛囊和细胞谱系图。一个多能干细胞隔室位于隆起处，位于皮脂腺正下方的外根鞘 (ORS) 中。ORS 与表皮的基底层相邻，形成毛囊的外鞘。内部或内根鞘 (IRS) 形成毛发通道；当毛干靠近皮肤表面时，IRS 退化，释放其附着在头发上的物质。毛干和 IRS 源自基质，即毛囊的瞬时扩增细胞。基质围绕着真皮乳头，真皮乳头是毛球中的一簇专门的间充质细胞。在隆起处发现的多能干细胞被认为有助于毛囊、皮脂腺和表皮的谱系（见红色虚线）。如图所示，在这些区域中的每一个中瞬时扩增凸出干细胞的后代（见绿色虚线）。

两项研究通过解剖大鼠 (16) 和人类 (17) 毛囊并在体外评估毛囊不同区域的克隆形成，证实了凸起角质形成细胞标记保留的相关性。在大鼠晶须毛囊中，每个毛囊约有 740 个集落形成细胞，其中 95% 位于隆起，其余 5% 位于基质区域。在人类头皮毛囊中，在隆起正下方的区域发现了最高的克隆形成；这些细胞被发现具有巨大的增殖能力，理论上单个细胞可产生多达 1.7 ×10³⁸个后代 (17)。在对 LRC 具有干细胞特性的创造性确认中，发现经过长时间追踪后从表皮培养的 LRC 比来自年龄相似的动物的脉冲标记细胞更具克隆形成性 (13)。因此，哺乳动物毛发表皮中克隆形成最多的细胞和具有最高标记保留能力的细胞出现在毛囊中，在凸起区域中或附近。

头发循环，毛囊在生物体的整个生命周期内反复再生以产生新的毛干，是研究干细胞特性的有用模型。根据“凸起激活假说”，凸起干细胞只有在接收到来自专门毛囊间充质细胞的信号后才会被刺激分裂并产生新的萌发毛发基质 (12)。为支持这一理论，已证明凸起细胞在卵泡再生前分裂 (18)。

定位假定的表皮干细胞代表了该领域的重大进展，使科学家能够在这一重要细胞群的生化和功能特征方面取得进展。其他干细胞领域，如造血系统，充满了细胞表面标记，这些标记几乎可以识别每一种细胞类型，从干细胞开始，一直延伸到后代类型的最分化形式。然而，表皮干细胞的特异性标记物尚不清楚。尽管这些细胞可以通过标记保留在体内或通过克隆形成在体外进行鉴定，但目前两种鉴定方法都不能轻易分离干细胞进行分析。因此，迫切需要特定的表皮干细胞标记物。

一类候选干细胞标记物是跨膜受体的整合素家族，其成员负责表皮基底层与其下层基底膜的附着（参见参考文献 19）。基底膜富含细胞外基质 (ECM) (20) 蛋白，其中许多构成整合素 αβ 异二聚体的配体。当培养的人角质形成细胞根据其表面整合素 β1 水平通过荧光激活细胞分选 (FACS) 分离时，具有最高荧光的细胞在体外表现出适度增加的集落形成效率 (21)。在这项研究中，集落形成效率与细胞粘附整合素配体的速度相关，包括 IV 型胶原蛋白 (α2β1) 和角质形成细胞分泌的 ECM 蛋白 (21)。在另一项研究中，人类角质形成细胞针对半桥粒整合素 α6 进行分类，它与 β4 结合以牢固地附着在基底膜成分层粘连蛋白 5 上，结果显示比针对粘着斑整合素 β1 进行分类的人角质形成细胞具有更高的增殖潜力，后者与 α2 混杂在一起 （IV 型胶原蛋白）、α3（层粘连蛋白 5）、α5（纤连蛋白）和角质形成细胞中的 α9（生腱蛋白）(22)。

当细胞从活体皮肤转移到培养条件时，整合素表达水平可能会发生变化，这可能会对将体外整合素表达数据外推到体内干细胞提出警告。然而，在这种情况下，直接从皮肤获得的人角质形成细胞的集落形成效率也与 IV 型胶原蛋白的快速粘附相关，这是具有升高的 α2 整合素的细胞的特征 (23)。此外，对来自不同区域的完整人类皮肤的免疫组织化学分析似乎显示出 β1 整合素表达水平的异质性；已假定表达增加的斑块含有干细胞 (23)。早期研究表明 β1 整合素信号传导在预防终末分化中的作用 (20)。皮肤上皮细胞中有条件地缺乏整合素 β1 的小鼠在基底膜组装和组织方面表现出严重缺陷，强调了这些整合素不仅在细胞外基质的附着和组装中的作用（参考文献 24 和 25；另见参考文献 26）。这些小鼠的伤口愈合受损；尽管 β1 无效角质形成细胞在受伤后在体内充分增殖，但它们迁移无效，导致再上皮化延迟 (27)。缺乏 β1 整合素的胚胎干细胞分化成角质形成细胞的能力下降，这种缺陷可以通过真皮衍生生长因子部分修复 (28)。考虑到 β1 缺失皮肤表型的严重性，皮肤干细胞区室是否依赖于 β1 整合素更难判断。

最近，两项调查造血干细胞、神经干细胞和胚胎干细胞转录谱的研究发现，与其瞬时扩增的后代细胞相比，整合素在这些干细胞中上调 (29, 30)。整合素 α6 存在于两个列表中，β1 存在于两个列表中的一个中。由于干细胞仅限于毛囊隆起或毛囊间表皮的基底层，因此有助于细胞-基质粘附的分子在概念上是有趣的干细胞标记物。干细胞可能需要牢固地粘附在基底膜上以维持其干细胞特性或它们在干细胞生态位中的位置。尽管有激发，但大多数（如果不是全部）增殖细胞在粘附过程中都使用整合素。因此，整合素作为干细胞标记物的有用性受到其相对于转运扩增干细胞后代的表达水平解释的不确定性的限制。

转铁蛋白受体是另一种表面标记物，显示其在干细胞和增殖后代之间的表达不同。在这种情况下，转铁蛋白受体表面表达减少与人类角质形成细胞干细胞有关。根据整合素 α6 和转铁蛋白受体对原代皮肤细胞进行分类，发现 LRC 富含 α6 高、转铁蛋白受体低的细胞，而活跃分裂的细胞则富含 α6 高、转铁蛋白受体高的细胞群 (31) .

即使在没有可用于分离干细胞的细胞表面标记的情况下，皮肤生物学家在理解一些在从干细胞转化为转运放大细胞中很重要的分子方面也取得了进展。一个这样的例子是原癌基因 c-myc，它是多种细胞类型增殖的转录调节因子，包括皮肤角质形成细胞 (32, 33)。有趣的是，c-myc 在转基因小鼠皮肤中的过度表达导致隆起的多能皮肤干细胞似乎被耗尽，这是通过 LRC 减少和伤口愈合受损来判断的 (34, 35)。令人惊讶的是，增加 c-myc 表达似乎也会导致细胞命运从毛囊祖细胞转变为皮脂生成细胞，这表明 c-myc 水平不仅可能影响干细胞子细胞成为转运放大细胞的决定，而且还决定采用哪个血统。

与干细胞和/或它们转化为转运扩增细胞相关的另一个因素是转录因子 p63，它是 p53 的同系物。已知 p63 在体内角膜缘的上皮干细胞和体外产生全克隆的皮肤角质形成细胞中表达 (36)。在 p63 基因位点具有靶向缺失的小鼠在表皮发育方面存在严重缺陷 (37, 38)。在早期发育中，当皮肤上皮细胞是单层时，p63 缺失的皮肤看起来很正常。然而，随着分层过程的进行，p63-null 皮肤上皮逐渐脱落，仅留下少数剩余细胞表达基底上标记而不是基底标记 (37)。

这些研究表明 p63 和 c-myc 都是皮肤角质形成细胞功能的重要调节剂。这两个因素仍未解决的一个主要问题是它们在多大程度上控制干细胞维持与转运扩增后代的产生。

大量证据支持这样的观点，即滤泡间表皮中的干细胞不如凸起干细胞有效，推测它们是多能凸起细胞的后代，也许是单能后代。与凸起细胞相反，滤泡间干细胞没有明确定义的生态位。凸起中的慢循环干细胞比滤泡间表皮中的多 (12)，凸起细胞中标记保留的寿命长于滤泡间细胞 (39, 40)。从凸起培养的细胞也比滤泡间细胞具有更高的克隆形成潜力 (17)。奇怪的是，隆起的 LRC 需要用佛波酯（12-O-tetradecanoylphor- bol-13-acetate，PMA) 重复处理以诱导增殖，而滤泡间 LRC 更容易诱导分裂 (39)。最后，破坏毛囊间表皮但毛囊完好无损的浅表烧伤不需要植皮，而毛囊被破坏的更深烧伤除了边缘外不能再生上皮 (41)。

这些特殊细胞可以产生所有皮肤上皮细胞谱系，包括滤泡间表皮，这一事实证明了凸起细胞的多能性（图 1B）。当在培养物中生长至汇合并移植到无胸腺小鼠上时，从解剖的凸起区域分离的细胞能够分化成分层表皮 (17)。慢循环干细胞的标记保留特性已被用于评估凸起细胞对多种表皮谱系的贡献。在 8 周追踪后保留标签的细胞，通过本研究中使用的技术专门驻留在凸起中，有助于毛囊的所有层 (40)。用两种不同的核苷酸进行脉冲标记，精确定时（基于细胞周期长度）来标记毛囊漏斗部区域的细胞，表明在正常和受伤状态下毛囊细胞都流出到毛囊间表皮中 (40)。在另一项试验中，凸起干细胞的多能性通过将表达 β-半乳糖苷酶的转基因晶须凸起细胞移植到未标记受体小鼠的毛囊凸起区域中得到证实 (42)。随着时间的推移，来自移植凸起的表达 β-半乳糖苷酶的细胞填充了所得嵌合毛囊的所有上皮隔室，包括皮脂腺和凸起上方的漏斗部区域，该区域被认为与滤泡间表皮最相似。

尽管支持凸起细胞多能性的证据令人信服，但该生态位之外的干细胞特征却不太确定。滤泡间表皮细胞是单能还是多能？它们在多大程度上（如果有的话）与隆起干细胞不同？这些问题的答案等待对凸起细胞的分子特征有更广泛的了解。然而，最近，Wnt 信号通路与皮肤上皮细胞获得和/或维持多能干细胞特征的能力有关 (43-45)。这条通路的核心是 β-连环蛋白，这是一种多功能蛋白，当细胞接收到 Wnt 信号时会稳定下来。β-连环蛋白以某种方式需要激活称为 Lef/Tcf 家族的 DNA 结合蛋白家族成员（参见参考文献 46）。在皮肤中，多能胚胎皮肤上皮细胞在承诺形成毛囊之前接收 Wnt 信号 (47)。当专门的皮肤间充质细胞抑制第二条信号通路，即骨形态发生蛋白 (BMP) 通路时，多能上皮细胞表达 Lef1 并致力于形成毛囊 (48)。根据 Lef1 (49-51)、Noggin (52) 或 β-连环蛋白 (53、54) 功能受损的小鼠这一事实判断，Wnt 和 BMP 信号通路似乎在功能上对毛囊的形成很重要，它们形成毛囊的能力都严重受损。

通常，只有隆起干细胞被认为在产后皮肤中保留了多能性。然而，当 β-连环蛋白在转基因小鼠皮肤中稳定时，成年毛囊间表皮表现为胚胎皮肤，似乎能够在表皮和毛囊命运之间做出选择 (44)。有趣的是，当毛囊的特殊间充质细胞（真皮乳头细胞）暴露于 Wnt 信号时，它们似乎也保留了毛囊诱导能力 (55)。因此，Wnt 信号可能既能作用于上皮细胞以诱导干细胞样特性，又能作用于间充质以维持其干细胞募集特性。

Lef1/Tcf 活性的程度对于确定干细胞谱系测定的结果可能至关重要。当 Lef1 在皮肤和口腔上皮细胞中过度表达时，偶尔会在不适当的地方看到毛发和牙齿 (43)。当无法与 β-连环蛋白结合的 Lef1 形式过表达时，毛囊细胞会在不适当的位置采用皮脂细胞命运，并在一些次级毛囊的位置形成表皮囊肿 (50, 51)。类似地，当有条件地靶向去除皮肤中的 β-连环蛋白时，观察到表皮囊肿代替毛囊 (53)。将来，探索现在已知影响 Lef1/Tcf 活性状态的其他蛋白质的水平和作用将很有趣（参见参考文献 56）。在这方面，Kielman 等人最近的平行发现。(57) 显示腺瘤性结肠息肉病 (APC) 通过控制 β-连环蛋白信号的剂量影响胚胎干细胞中干细胞谱系的确定，这很有趣。此外，现在有许多报告表明 β-连环蛋白及其伙伴在干细胞和命运规范中具有更全面的作用（参见参考文献 58-60）。

干细胞生物学的基础研究部分是为了最终可能从患者身上获取干细胞，对其进行修饰或扩增，然后重新植入以治疗疾病。皮肤角质形成细胞已被证明对此有用，因为它们的可及性和培养能力。培养的角质形成细胞最突出的临床用途是产生融合的上皮片，可以将其从培养皿中轻轻取出并用于重建烧伤、慢性伤口和溃疡的上皮部分。这种方法的优点是使用患者自己的皮肤，这代表了最佳的长期再增殖策略。今天，最常用的皮肤移植技术采用了一种不同的方法，即使用从未受影响的皮肤中提取的分层厚度移植物。这种方法是有效的，但它受到未受影响皮肤的可用表面积的限制，并会造成一定程度的额外伤害。使用培养的角质形成细胞允许覆盖更大的表面并且需要更小的未受影响的皮肤区域，从中收获角质形成细胞用于培养。目前，培养的角质形成细胞的使用受限于在体外生长上皮片所需的时间长度，在此期间患者容易受到感染。上皮层也非常脆弱，不能很好地粘附在一些烧伤表面上。正在开发的皮肤替代品可以起到真皮等效物的作用，以保持扩张的角质形成细胞，提高对烧伤伤口的粘附性，并形成临时伤口覆盖物以降低感染率。如果可以将亚融合的角质形成细胞培养物植入真皮等效物中，那么这种移植物可以在烧伤后很早就应用，随着上皮覆盖的成熟，而真皮等效物起到临时敷料的作用，从而避免了两次手术的需要 (61)。

移植培养的皮肤上皮干细胞除了替代烧伤皮肤外，还有其他潜在的应用；特别是，考虑使用培养的角质形成细胞作为基因治疗的传递工具的可能性是令人兴奋的。两个小组已经设计出使用培养的人类角质形成细胞来纠正先天性代谢性皮肤病的方法 (62, 63)。从患有隐性营养不良性大疱性表皮松解症的患者身上采集角质形成细胞，并通过使用噬菌体整合酶对正确序列进行基因组整合或使用慢病毒进行转基因表达来纠正遗传缺陷。修复后的角质形成细胞在培养物中扩增并移植到裸鼠上以产生缺陷得到纠正的健康上皮细胞。尽管这两项研究都没有将干细胞移植回患有皮肤病的原始人类身上，但这些努力代表着操纵干细胞治疗人类疾病的可能性取得了重大进展。

正在寻找皮肤上皮干细胞自我更新和产生将填充一个或多个表皮谱系的子细胞的生化调节剂。在过去的三十年里，该领域取得了显着进步，尤其是在离散干细胞隔室的存在和位置方面。一些初步工作将整合素作为细胞表面标记物，虽然不是特异性的，但可能有助于丰富干细胞的细胞群以进行表征。C-myc 和 p63 也被确定为干细胞命运的调节剂。此外，近年来出现了一连串报道，涉及 Wnt 信号、β-连环蛋白和 Lef1/Tcf 转录调控在干细胞维持和/或谱系确定中的作用。尽管取得了这些进展，科学家们仍无法可靠地从皮肤上皮细胞中分离出干细胞，以详尽地研究它们的转录和功能特征。最终，当存在找到这些问题答案的技术时，医生不仅可以使用皮肤上皮干细胞生长新皮肤来治疗烧伤，还可以治疗皮肤遗传病，甚至可能是非皮肤病。我们还不知道未来是否有可能对角质形成细胞进行基因工程改造以诱导分泌肽类激素，例如用于治疗糖尿病的胰岛素，或用于治疗生长激素缺乏症的生长激素 (64)。我们也不知道角质形成细胞干细胞是否具有足够的可塑性以分化成非角质形成细胞类型以纠正其他组织的缺陷。过去三十年的研究表明，皮肤干细胞研究的未来前景广阔。