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优化代谢以提高CAR-T细胞的功效

介绍

CAR-T细胞疗法是继手术、化疗和靶向治疗之后第四大常见的肿瘤治疗选择,在治疗恶性血液肿瘤方面取得了成功。然而,CAR-T细胞疗法存在复发率高和实体瘤疗效差的缺点。造成这种情况的一个关键原因是肿瘤细胞代谢失调,这会给CAR-T细胞带来大量代谢干扰,导致CAR-T细胞治疗功能失败。因此,迫切需要确定增强CAR-T细胞治疗的新策略。

传统过程通常需要 2-6 周。新方法可以将自体 CAR-T 细胞的制造时间从行业标准时间缩短。FasT CAR平台能够使用源自慢病毒的XLenti载体同时激活静息T细胞并将其转导为单个“同时激活-转导”步骤。ASH年会的摘要显示,在CAR-T细胞制造过程中,每个阶段都有不同的功能和代谢要求,微小的变化会对CAR-T细胞治疗的疗效和副作用产生很大的影响[7](图 1)

优化代谢以提高CAR-T细胞的功效

图 1 T细胞根据其功能有不同的代谢需求。

T细胞代谢的重新编程

 

T细胞亚群分为幼稚T细胞(Tn)、效应T细胞(Teff)、中枢记忆 (Tcm)、效应记忆(Tem)等,每种都有不同的功能和代谢要求。T细胞活化和代谢重编程同时发生。

Tn的代谢主要依靠氧化磷酸化(OXPHOS)和脂肪酸氧化(FAO)来提供能量。遇到抗原后,TCR和CD28协同激活PI3K-AKT-mTOR通路。T细胞活化信号通路(例如PI3K-AKT-mTOR 通路)激活转录因子(例如HIF-1α、c-Myc),从而上调1型葡萄糖转运蛋白(GLUT1)的表达以促进糖酵解。然而,无论是通过交联TCR/CD3复合物激活还是单独连接CD28,都不会引起Glut1表达的显着变化。总之,这使细胞能够满足快速增殖和细胞因子产生的代谢需求。这导致Tn细胞分化为Teff细胞。记忆T细胞的代谢模式与Tn相似,但具有稍高程度的OXPHOS和线粒体备用呼吸能力,这使得记忆T细胞在遇到抗原时迅速激活。一旦抗原被清除,大多数Teff会发生凋亡,少数会分化为记忆 T细胞。这时,代谢必须从糖酵解转化为FAO。代谢是决定记忆T细胞命运的主要驱动因素。活化的T细胞通过调节代谢来控制代谢中间体的数量和类型,这些中间体用于控制关键基因转录的表观遗传反应,促进T细胞分化为记忆T细胞。然而,这一过程所涉及的具体机制仍然知之甚少。

目前大多数可用的 CAR-T 疗法都是使用慢病毒制造的。在制造CAR-T细胞时,我们首先通过白细胞分离术或Ficoll获得PBMC。PBMC被纯化获得T细胞,然后用抗分化簇3(CD3)/CD28磁珠刺激T细胞以促进增殖和分化。此时,新陈代谢被重新编程(从FAO到糖酵解)。在激活过程中,需要更多葡萄糖的细胞倾向于分化为Teff,而那些需要较少葡萄糖的细胞优先形成记忆T细胞。

接下来,T细胞被转导,最常见的是通过慢病毒感染。也就是说,将获得的T细胞亚群与编码CAR的慢病毒载体一起孵育。研究表明,T细胞亚群的组成及其代谢适应性与其抗肿瘤活性密切相关。由纯化的CD4+或CD8+ Tcm或Tn制成的CD19 CAR-T细胞已被证明具有增强的代谢适应性和长期抗肿瘤反应。与标准制造的CD19 CART 相比,源自TSCM的CD19 CART显示出良好的长期反应,但尚不清楚是否只是具有更多的Tscm或Tscm的糖酵解减少会驱动长期反应。研究表明,这可能与早期记忆表型和FAO依赖性OXPHOS有关。

最后,CAR-T细胞在体外扩增到一定数量。在重新悬浮和纯化后,细胞通过输注返回给患者。临床研究表明,具有较高比例的记忆T细胞和糖酵解的19种CAR-T细胞增加了慢性淋巴细胞白血病细胞(CLL)患者CR的机会。制造CAR-T过程中的其他条件,例如感染温度,也会影响CAR-T的分化。是否影响新陈代谢需要通过慢病毒技术进一步研究。

 

优化代谢提高生产效率

CAR-T细胞以及用于制造CAR-T细胞的T细胞的分化和代谢状态在调节抗肿瘤活性方面发挥着重要作用。由于CAR-T细胞制造过程易于操作,因此可以通过优化新陈代谢来改变T细胞分化以提高抗肿瘤活性。CAR-T细胞制造过程的每个阶段都需要不同类型的新陈代谢。在CAR-T细胞的体外生长和制造阶段,T细胞被CAR转导并在患者输注之前大量生长。适当抑制代谢可维持未分化状态,提高抗肿瘤活性。然而,CAR-T细胞需要强大的体内代谢活性(同时增强糖酵解和线粒体代谢)来支持细胞增殖的生物合成中间体的产生(图 2)。

优化代谢以提高CAR-T细胞的功效

图2  T细胞和CAR-T细胞体外扩增需要适当的代谢(直接或间接抑制糖酵解)维持未分化状态,可延长体内持续时间,增强抗肿瘤活性;然而,在体内,有必要增强代谢(糖酵解或OXPHOS)活性以维持高侵袭潜力和杀伤功能。

在T细胞扩增期间抑制糖酵解以限制分化

如上所述,纯化的T细胞一旦获得,必须在体外扩增3天,然后才能用于制造CAR-T细胞。在此过程中,除了CD3/CD28磁珠外,还会定期添加细胞因子。白细胞介素2 (IL-2) 是最常添加的细胞因子,因为它促进T细胞的糖酵解和快速增殖。IL-2还介导T细胞扩增和效应分化的生理耦合;然而,细胞扩增和效应分化的耦合对提高免疫治疗的疗效构成了主要的治疗障碍。多项研究表明,T细胞代谢是扩增和分化的关键调节因子。T细胞增殖和分化可以通过代谢途径的操纵来解耦。在制CAR-T细胞之前,可以通过直接抑制糖酵解(糖酵解抑制剂抑制PI3K/AKT 信号通路)或间接(促进线粒体功能、优化培养基)将T细胞维持在未分化状态。

CAR-T细胞制备阶段:选择抑制糖酵解的CAR结构维持低分化

CAR的结构包含可变区抗体的单链片段、跨膜结构域、共刺激分子和细胞内信号结构域。CAR-T细胞技术现在已经发展了五代。目前市场上的产品都是第二代CAR-T细胞。在CAR-T细胞制备阶段,可以利用抑制糖酵解的CAR结构来维持幼稚,提高CAR-T细胞治疗的疗效。例如,选择有利于OXPHOS的共刺激因子和抑制糖酵解的PI3K抑制区域的共表达。

体外扩增CAR-T细胞:抑制糖酵解并维持未分化状态

与T细胞相比,CAR-T细胞中的CAR-CD3ζ ITAM信号可以促进分化,使CAR-T细胞更容易分化为Teff和Tem细胞,结果是CAR-T细胞在体内的持久性较差。因此,通过调节CAR-T细胞扩增过程中的代谢途径来解耦CAR-T细胞的增殖和分化就显得尤为重要。

优化培养基

通常,CAR-T细胞是使用富含碳水化合物和氨基酸等营养物质的培养基在体外产生和扩增的。然而,肿瘤微环境(TME)中缺乏氧气和营养物质限制了CAR-T细胞的扩增和功能。因此,在扩增过程中,优化培养基成分,适当抑制CAR-T细胞的糖酵解,有助于提高代谢适应性,维持低分化状态。例如,添加精氨酸可以促进OXPHOS并抑制糖酵解。添加肌肽可以中和有氧糖酵解产生的细胞外质子,并且可以将CAR-T细胞代谢从糖酵解转变为OXPHOS。

特别是,添加到CAR-T细胞培养物中的最常见的细胞因子IL-2可促进糖酵解以促进T 细胞快速增殖。然而,它也可能驱动终末分化或活化诱导的细胞死亡。调整IL-2添加到培养基中的浓度和时间可以减少CAR-T细胞的副作用并提高疗效(增加记忆CAR-T细胞亚群的比例)。其他类型的细胞因子,如IL-15,通过降低mTORC1活性和抑制其糖酵解活性来改善代谢适应并保持CAR-T细胞的干细胞记忆表型。IL-21将代谢转向FAO和OXPHOS,以促进Tcm细胞的形成。IL-7和IL-15不仅可以诱导 Tscm 的形成,还可以逆转CAR-T细胞耗竭。综上所述,这些数据表明,适当优化代谢可以产生具有很强代谢适应性的CAR-T细胞。为了使CAR-T细胞在输注前达到最佳状态,需要进一步研究最佳培养基成分(包括细胞因子、营养物质等)的比例。

简而言之,CAR-T细胞可以直接通过抑制糖酵解或间接通过增强线粒体代谢来维持低分化状态。这种代谢的可调节性为促进CAR-T细胞功能提供了机会。

注入患者体内后促进CAR-T细胞功能的策略

将CAR-T细胞注入患者体内时,必须考虑体内代谢需求,而体外则相反。具有高代谢活性的T细胞可以更好地杀死肿瘤细胞。然而,CAR-T细胞的代谢受到缺氧和营养缺乏的影响。CLL会降低T细胞的葡萄糖摄取并损害线粒体的生物合成。最近的研究表明,增强体内糖酵解或线粒体代谢可以改善CAR-T细胞的功能。此外,由于肿瘤细胞与CAR-T细胞之间的竞争性代谢,还可以通过抑制肿瘤细胞的代谢来促进CAR-T细胞在体内的功能。

增强葡萄糖代谢

在TME中,转化生长因子-β(TGF-β)影响T细胞糖酵解和 OXPHOS,进而影响T细胞功能。通过CRISPR抑制TGF-β可以促CAR-T细胞对实体瘤的长期治疗效果。2019年ASCO年会摘要(一项临床研究)表明,共表达显性阴性TGF-β的CART-PSMA-TGFβRdn在治疗前列腺癌方面是安全有效的。已观察到对托珠单抗有反应的可逆CRS。抑制TGF-β可能同时增加TME中CAR-T细胞的葡萄糖代谢和 OXPHOS。然而,需要更多的数据来支持这一点。

此外,TME中的抑制性细胞因子和分子可激活磷酸酶并抵消AKT信号。在ALL小鼠模型中,GLUT1或AKT的表达增加了T细胞效应功能。为了克服TME中AKT表达的下调,使CAR-T细胞过表达 Akt 可提高抗肿瘤功效。与caAkt-GD2-CAR 共转导的T细胞产生更多的Th1细胞因子和颗粒酶B,从而增加了对LAN-1神经母细胞瘤细胞的细胞毒活性。然而,持续的Akt激活会驱动CD8+ T细胞记忆的终末分化和丧失。上文提出,在体外CAR-T细胞培养过程中抑制PI3K/AKT信号通路,可通过抑制糖酵解延缓CAR-T细胞分化,使表型趋于持续更长时间的记忆T细胞。然而,过表达AKT的CAR-T细胞增强了T细胞的效应功能。这两项研究从不同的角度操纵了CAR-T细胞以增强抗肿瘤功效,并值得进一步研究以确定哪种方法更优越。

在TME中,肿瘤细胞迅速消耗细胞外葡萄糖,抑制T细胞糖酵解和下游代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的产生。除了在糖酵解中的作用外,PEP还调节T细胞中的细胞质Ca2+浓度和NFAT1活化,并且是调节抗肿瘤反应的关键代谢物。过表达PCK1的T细胞会增加PEP的产生,限制肿瘤生长,并延长黑色素瘤小鼠的存活时间。此外,Von Hippel Lindau基因或脯氨酰羟化酶的突变或敲除可以增强糖酵解,促进抗肿瘤活性,并延长T细胞的持久性。这种观点似乎与抑制糖酵解延长T细胞的持久性相矛盾,这再次证明了T细胞代谢的复杂性。

增强线粒体代谢

研究表明,在CAR-T细胞治疗期间增强线粒体生物合成 (MB)可以改善CLL患者的预后。PGC-1α是MB的关键调节因子,调节OXPHOS和FAO(记忆T细胞的主要代谢特征)。PGC-1α的激活剂与检查点抑制剂协同作用,通过增强线粒体代谢活性来增加T细胞中ROS的产生,从而促进T细胞的抗肿瘤作用。CD8+ TIL过表达PGC1α可以改善线粒体的质量和功能,恢复耗尽的T细胞的抗肿瘤能力。最近的研究表明,过表达 PGC1α(mf CAR-T)的CAR-T细胞增加了代谢适应的靶基因(ERRα、TFAM和NRF2)的表达。通过改善线粒体的质量和功能,在低葡萄糖条件下保持高肿瘤杀伤能力。mf CAR-T是一种很有前途的新策略,可以改善TME中CAR-T细胞的功能。

在2020年ASH年会上提交的一份初步报告表明,增强肿瘤部位免疫细胞的线粒体代谢可以促进肿瘤杀伤。FOXM1基因的过表达诱导CAR-i Tscm,并通过促进线粒体生物合成、脂肪酸合成和OXPHOS增强抗肿瘤作用。

抑制肿瘤细胞代谢

肿瘤细胞的代谢调节TME的代谢状态。肿瘤中糖酵解水平的增加称为“Warburg 效应”,T细胞的效应功能也依赖于糖酵解。最近的一份出版物表明,葡萄糖最常被肿瘤中的骨髓细胞利用,其次是T细胞和肿瘤细胞。由于骨髓细胞是葡萄糖等营养物质的主要消耗者,免疫细胞和肿瘤细胞直接竞争TME中剩余的营养物质。肿瘤细胞的糖酵解活性可能会限制CAR-T细胞对葡萄糖的摄取。葡萄糖剥夺不仅会影响Tn向Teff的分化,还会抑制钙信号转导,影响IFN-γ的产生和细胞毒性T细胞的功能。因此,肿瘤细胞和T细胞之间的代谢竞争可能与CAR-T细胞的抗肿瘤功能降低、疗效差和肿瘤进展有关。PD-L1/PD1轴影响肿瘤和T细胞代谢。

PD-L1在激活Akt-mTOR以促进糖酵解、增加葡萄糖摄取和增强与T细胞的葡萄糖竞争的癌细胞上表达。多项研究表明,通过单克隆抗体或工程化CAR结构阻断PD-L1/PD1轴可提高CAR-T细胞的功效。原因之一是阻断PD-L1/PD1轴直接抑制肿瘤细胞的糖酵解,恢复TME中的葡萄糖,从而促进CAR-T细胞的糖酵解和IFN-γ的产生。另一个原因是它可能直接促进 CAR-T细胞代谢和逆转 CAR-T失败。

除了抑制 PD-L1/PD1 轴外,糖酵解抑制剂也可用于直接抑制肿瘤细胞代谢,但肿瘤细胞与免疫细胞之间的代谢相似性可能导致直接抑制肿瘤细胞代谢,从而影响疗效的免疫疗法。选择 GLUT1 抑制剂或生酮饮食可能是在不损害 CAR-T 细胞功能的情况下抑制肿瘤细胞葡萄糖代谢的潜在方法。

一些复杂的技术,如CRISPR可用于在临床环境中对患者的T细胞代谢进行基因改造。CRISPR/Cas9可以敲除甘油二酯激酶,增加TCR信号,促进CAR-T细胞的杀伤功能。DGK KO增强了TCR远端信号(ERK 磷酸化被放大并持续更长时间),从而增加了139个CAR-T 细胞的效应功能。浏览CRISPR/Cas9文库和筛选结果显示REGNASE-1可以促进代谢衰竭,并且Regnase-1-null CAR-T 细胞显示出比野生型细胞更强的治疗效果。

结论

通过调节新陈代谢来改善CAR-T细胞功能具有挑战性。增强糖酵解代谢可促进早期增殖和细胞因子(如IFN-γ)的产生,但持久性较差。增加T细胞的糖酵解使它们更加分化为Teff,从而可以产生更多的IFN-γ。

这些细胞具有高侵袭潜力,但寿命短,不利于分化为基于OXPHOS代谢的记忆T细胞。另一方面,向OXPHOS的转变促进了向记忆T细胞的分化,但增殖可能受到限制,迁移能力和杀伤功能可能会降低。在杀伤肿瘤的过程中,我们需要寿命长、侵袭能力强、杀伤功能高的CAR-T细胞。这促使我们计划如何在制造过程中更好地调节CAR-T细胞的代谢。在体外扩增T细胞或 CAR-T 细胞期间适当抑制糖酵解(直接或间接)有助于记忆T细胞的形成,后者与CAR-T细胞在体内的持久性和治疗功效直接相关。然而,需要增强CAR-T细胞在体内的代谢才能更好地发挥杀伤功能。

最近的研究将AMPK的γ亚基克隆到慢病毒载体中,以增加CAR-T细胞中的AMPK信号传导,在体外促进扩增,同时促进记忆T细胞的分化。聚糖基化IL-10(AM0010)可以在体外和体内增强 CAR-T细胞的细胞毒性。通过对人IL-2的一个亚基(ortho-hIL-2)进行基因改造,与重组IL-2相比,除了在体外促进T细胞增殖外,还可以在体内促进T细胞增殖。通过基因改造对ortho-hIL-2进行轻微调整,不仅可以促进体外T细胞增殖,还可以促进体内T细胞增殖。

随着CRISPR等学科的发展,未来可能在体内更精细地调控CAR-T细胞代谢。

Optimization of metabolism to improve
efficacy during CAR-T cell manufacturing

https://doi.org/10.1186/s12967-021-03165-x

 

 

 

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