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北京协和医院Cells | 穴位电针和人iPS细胞衍生的外泌体联合治疗缺血性脑中风

穴位电针和 iPSC-EVs 治疗可以减少缺血性卒中小鼠的梗死体积、改善运动功能和神经功能,并抑制神经元凋亡。

2022 年 3 月Cells发表一篇题为herapeutic Potential of a Combination of Electroacvupuncture and Human iPSC-Derived Small Extracellular Vesicles for Ischemic Stroker(电针和人 iPSC 衍生的小细胞外囊泡联合治疗缺血性中风的治疗潜力)的文章,作者来自中国医学科学院北京协和医院中医科Peiying Deng、Liang Wang等。

 

电针疗法:电针疗法是指在刺入人体穴位的毫针上,用电针机通以微量低频脉冲电流的一种治疗方法。电针是在针刺腧穴得气后,在针上通以接近人体生物电的微量电流以防治疾病的一种疗法。它的优点是:在针刺腧穴的基础上,加以脉冲电的治疗作用,针与电两种刺激相结合,故对某些疾病能提高疗效;能比较正确地掌握刺激参数;代替手法运针,节省人力。

 

缺血性脑中风缺血性脑中风、脑血栓、脑栓塞、腔隙性缺血性脑中风和多发性缺血性脑中风及小中风都属于缺血性脑中风,就是指脑血管狭窄或闭塞,导致脑血流阻断而使脑组织发生缺血缺氧、软化甚至坏死,致使脑血管功能障碍,引起相关症状。缺血性脑中风是脑血管疾病的主要类型,约85%的脑中风是缺血性的。据《2018中国卫生和计划生育统计年鉴》,全国缺血性脑中风现患病人数高达1242万。

 

穴位电针+外泌体联合治疗缺血性脑中风

 

北京协和医院的研究人员在Cells的这篇文章,探讨了电针(EA)联合诱导多能干细胞衍生的小细胞外囊泡(iPSC-EVs)对缺血性卒中小鼠的作用及其潜在机制。

 

通过大脑中动脉闭塞(MCAO)在C57BL/6小鼠中建立局灶性脑缺血模型。研究人员发现3天后,通过行为测试检查神经损伤和运动功能。使用TTC染色和TUNEL测定检查梗塞体积和神经元凋亡。进行流式细胞术以评估T淋巴细胞的增殖。通过免疫荧光和蛋白质印迹评估白细胞介素 (IL)-33/ST2 轴的变化。

 

最终发现,细胞外囊泡和 iPSC-EVs 治疗的组合改善了 MCAO 小鼠的神经损伤并减少了梗塞体积和神经元凋亡。电针加 iPSC-EV 抑制 T 辅助细胞 (Th1) 和 Th17 反应并促进调节性 T 细胞 (Treg) 反应。

 

此外,电针加 iPSC-EVs 通过调节 IL-33/ST2 轴和抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化发挥神经保护作用。该研究表明电针和 iPSC-EVs 在 MCAO 小鼠中发挥了协同神经保护作用,这种治疗可能代表了一种新的有效治疗缺血性中风和其他组织损伤的方法。

 

缺血性中风导致患者出现永久性残疾

 

缺血性中风是一种常见的神经系统疾病,可导致全世界患者出现永久性残疾。缺血性卒中诱发的神经炎症在导致卒中后继发性脑损伤的多种机制中发挥着重要作用。目前的临床最佳治疗是静脉溶栓或血管内血栓切除术,但两者都对时间关键性要求较高。因此,必须开发一种新的治疗方法来减少缺血再灌注损伤。

 

T 淋巴细胞是缺血性中风诱发的神经炎症的关键介质。T 辅助细胞 1 细胞 (Th1) 促进炎症,Th2 细胞优先诱导抗炎反应。因此,Th1/Th2 平衡可以提供对炎症反应调节的深入了解。

此外,之前的一项研究显示,缺血性卒中患者的 Th17 细胞显着增加,外周调节性 T (Treg) 细胞显着减少,这表明外周 Th17/Treg 失衡可能是缺血性卒中发病机制的基础。

 

最近的研究还报道了小鼠大脑中 Treg 细胞数量的上调,这些细胞可能促进中风后的功能恢复和大脑修复。因此,对 T 淋巴细胞的作用进行更深入的研究对于缺血性卒中治疗至关重要。

 

诱导多能干细胞技术带来的医学变革

 

自 2006 年发现 iPSC 技术以来,诱导多能干细胞 (iPSC) 已成为脑血管疾病治疗中最有希望的干细胞来源之一,因为它们在组织再生、自我更新能力和分化方面具有巨大优势潜在的。

 

尽管 iPSC 的管理受到低植入率和潜在的肿瘤发生风险的限制,但最近的研究证明,移植干细胞的有利作用很大程度上归因于它们释放的外泌体,因为外泌体具有低免疫原性,低毒性,以及穿过血脑屏障的能力。外泌体的给药已被用作缺血性中风的治疗方法。

 

据报道,M2 小胶质细胞分泌的外泌体可改善缺血性脑损伤并促进神经元存活。一项研究还报道,间充质干细胞 (MSC) 衍生的外泌体有利于中风后的神经元重塑和功能恢复。

 

根据越来越多的证据,外泌体通过其货物(包括脂质、蛋白质和核酸)改善了缺血性卒中治疗的功能结果。最近的一份报告证实,源自 iPSC 产生的神经元的外泌体可促进神经发生并调节神经回路的发育。这些观察结果表明,iPSC 衍生的小细胞外囊泡 (iPSC-EVs) 的应用可能是一种有前途的中风治疗方法;然而,它们的细胞目标仍然不明确。

 

电针:传统针灸和电刺激的技术

 

电针(EA)作为一种结合传统针灸和电刺激的技术,已被用于中风和中风后的康复,因为它可以改善神经功能障碍而没有明显的副作用。研究表明,电针治疗可有效减轻炎症损伤并在缺血性中风中发挥神经保护作用。

 

因此,电针和iPSC 衍生的小细胞外囊泡 ( iPSC-EV) 都是有前景的中风临床治疗策略。有关研究报道了“百会”(GV20)和“足三里”(ST36)穴位的电针治疗可以减轻大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠的神经元损伤。然而,电针和 iPSC-EVs 调节神经炎症的具体机制仍不清楚。

 

因此,北京协和医院等研究人员研究探讨了穴位电针 治疗和 iPSC-EVs 组合对脑缺血性损伤的潜在影响,发现穴位电针和 iPSC-EVs 在 MCAO 小鼠中调节 IL-33/ST2 诱导的炎症反应。

 

研究结果

 

1.穴位电针和 iPSC-EV 联合治疗可改善缺血性中风后的运动功能障碍

 

研究人员使用 MCAO 小鼠模型来确定电针和 iPSC-EVs 对缺血性中风小鼠运动功能的影响(详细的穴位位置如下图所示)。将小鼠分为六组,rCBF 在缺血前和缺血期间以及再灌注后 5 分钟进行监测。rCBF 减少在整个闭塞期间保持稳定,并在所有组中移除灯丝后立即恢复到缺血前水平。首先,使用局灶性神经量表评估小鼠的神经损伤。MCAO组的Clark评分显着高于假手术组。用 EA、iPSC-EV 或两者治疗后,Clark 评分显着降低,表明神经损伤显着减轻。假针灸治疗在 MCAO 后没有改变分数。圆柱体和开放场测试也表明 EA、iPSC-EV 和 EA + iPSC-EV 组中的小鼠在 MCAO 后 72 小时的运动表现出显着改善。特别是电针+iPSC-EVs组表现出更显着的改善,表明电针联合iPSC-EVs治疗对改善缺血性脑损伤后的神经功能和运动功能有更好的效果。

 

北京协和医院Cells |  穴位电针和人iPS细胞衍生的外泌体联合治疗缺血性脑中风

2.EA 和 iPSC-EVs 治疗可减轻缺血性脑损伤

为了确认 EA 和 iPSC-EVs 在 MCAO 小鼠中的作用,用 TTC 染色检查梗塞体积,并用免疫荧光分析神经元凋亡。在 MCAO 组中,缺血诱导的梗死体积在中风后 72 小时显着增大。令人惊讶的是,用 EA 和 iPSC-EVs 治疗显着减少了缺血诱导的梗塞体积,而假针灸治疗对梗塞体积没有影响。

此外,与 MCAO 小鼠相比,EA 治疗小鼠的皮层梗塞体积减少了 15.5%,纹状体减少了 12.6%,整个半球减少了 14.5%,而 iPSC-EVs 治疗和 EA+iPSC- EVs 治疗的小鼠,皮层的梗死体积分别减少了 14.4% 和 24.7%,纹状体减少了 9.3% 和 18.9%,整个半球分别减少了 11.4% 和 26.5%。此外,梗死面积的减少并未偏向特定水平。

另外,TUNEL 试验的结果证实,与假小鼠相比,MCAO 小鼠梗塞核心区域的神经元凋亡显着增加,并且用 EA+iPSC-EVs 治疗的小鼠的神经元凋亡幅度显着降低。EA 和 iPSC-EVs 组之间没有显着差异,但在 EA 和假针灸组之间观察到显着差异。总之,EA 或 iPSC-EV 可减轻 MCAO 小鼠模型中缺血引起的脑损伤,并且 EA 与 iPSC-EV 联合的整体治疗效果优于其他两种药物。

 

3.EA 和 iPSC-EVs 治疗调节 MCAO 小鼠中 Th 细胞的增殖

 

研究人员使用流式细胞术检测了 MCAO 后 72 小时小鼠外周血中 Th 细胞亚群的表达情况探索 EA 或 iPSC-EVs 是否调节 MCAO 诱导的 T 细胞免疫反应。MCAO 后 IFN-γ+ Th 细胞和 IL-17+ Th 细胞的水平显着增加,而这些异常增加在 EA-、iPSC-EVs-或 EA+iPSC 中显着抑制-EVs 治疗的动物,尽管 EA+iPSC-EVs 组的减少明显更大。

 

三个治疗组之间没有显着差异,但在电针组和假针刺组之间观察到显着差异。相比之下,EA 和 iPSC-EV 的组合在防止 MCAO 诱导的 Foxp3+ Treg 细胞数量减少方面发挥了显着的协同作用。在 MCAO 之后,IL-4+ Th 细胞的数量在任何组之间没有显着差异。基于这些结果,EA 和 iPSC-EVs 治疗的组合是调节 MCAO 诱导的炎症反应的更有效的治疗方法。

 

4.EA 和 iPSC-EVs 治疗调节星形胶质细胞中 IL-33/ST2 的激活

 

IL-33 通过与星形胶质细胞或小胶质细胞表面的 ST2 受体结合,参与调节神经炎症。进行免疫荧光和蛋白质印迹以评估 EA 和 iPSC-EVs 对 IL-33/ST2 活化的贡献。

 

与假对照小鼠相比,MCAO 小鼠病变部位的 IL-33 免疫反应细胞数量和 IL-33 蛋白水平均显着增加。与单独使用 EA 或 iPSC-EVs 治疗相比,EA+iPSC-EVs 治疗对 MCAO 诱导的 IL-33 表达增加具有更好的抑制作用。

 

尽管 EA 和 iPSC-EVs 治疗在 72 小时显着抑制了 MCAO 诱导的梗塞区域 IL-33 的上调,但这些治疗之间没有观察到显着差异。

 

一致地,GFAP 染色显示 MCAO 诱导的脑中 IL-33 表达伴随着 MCAO 小鼠星形胶质细胞的激活,并且这种变化通过 EA、iPSC-EV 或 EA+iPSC-EV 治疗显着缓解。这种效果在 EA+iPSC-EVs 治疗的小鼠中更为显着,而接受假针灸治疗的小鼠与 MCAO 小鼠没有差异。

 

此外,免疫荧光结果反映 IL-33 位于星形胶质细胞中。ST2 表达的趋势相似,因为 MCAO 后 72 小时病变部位 ST2 表达增加被 EA 和 iPSC-EVs 治疗逆转,尤其是在 EA+iPSC-EVs 治疗的小鼠中;假针灸治疗没有这种效果。这些发现表明,EA 联合 iPSC-EVs 治疗通过促进星形胶质细胞中的 IL-33/ST2 轴激活来调节 T 细胞反应。

 

5.EA 和 iPSC-EVs 治疗可防止脑缺血引起的小胶质细胞活化

 

最近的一项研究证实了脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞形态和功能的一系列变化。小胶质细胞以其“静止”状态存在,其特征在于分枝形态。活化的小胶质细胞在形态上发生显着变化。缺血再灌注后,梗死区小胶质细胞迅速增殖并活化,活化的小胶质细胞周核逐渐变大,分支减少。

 

研究人员应用免疫荧光染色在 MCAO 后 72 小时检测小胶质细胞表型标志物,并验证 EA 和 iPSC-EVs 是否也抑制小胶质细胞活化。MCAO 导致 Iba1+ 细胞总数和活化的 Iba1+ 细胞数量显着增加,而在 EA-、iPSC-EVs- 和 EA+iPSC-EVs 处理的小鼠中,这种增加被显着抑制,尤其是在接受 EA+iPSC-EVs 组合的小鼠中治疗。

 

相反,在 MCAO 后观察到静息 Iba1+细胞的数量显着减少,并且这种趋势通过 EA 或 iPSC-EVs 治疗得到显着阻止,尤其是在 EA+iPSC-EVs 组中。因此,EA 和 iPSC-EVs 治疗也抑制了 MCAO 诱导的小胶质细胞活化。

 

结论与展望

 

缺血性中风会促进活性氧 (ROS) 和氧化应激的增加,从而导致促炎细胞因子的产生。神经炎症是局灶性脑缺血的主要后果,并导致神经元损伤。

 

在目前的研究中,北京协和医院的科学家们研究了 iPSC-EV 和 EA 的神经保护作用,并使用 MCAO 小鼠模型探索了可能的机制。用 iPSC-EVs、EA 或两者的组合治疗大大减轻了缺血引起的脑损伤。iPSC-EVs 和 EA 的治疗效果与通过调节 IL-33/ST2 通路抑制炎症有关。

 

使用 iPSCs 的基于细胞的治疗是减轻缺血性脑损伤的一种潜在的有前途的方法。然而,iPSCs 的使用可能会受到其致瘤潜力的影响。根据最近的研究,干细胞的积极贡献主要是通过其旁分泌机制,而 EV 在此过程中至关重要。

 

干细胞衍生的外泌体技术在多个领域取得了长足的进步。iPSC-EVs 的治疗优势已在多种疾病中得到证实,例如肝缺血再灌注损伤和急性心肌缺血再灌注,这些研究记录了令人鼓舞的结果。然而,iPSC-EVs 治疗缺血性脑中风(卒中)的机制需要更多的研究。

 

电针作为一种经济、方便的治疗方法,可用于缓解缺血性脑卒中症状。由于疾病的复杂性,与单一穴位相比,穴位组合增加了电针的疗效。如之前的研究所示,“百会”(GV20)和“足三里”(ST36)穴位组合的电针通过抑制内质网应激和改善MCAO大鼠线粒体功能损伤,对减轻神经元损伤发挥协同保护作用。

 

研究人员证明了两个穴位的组合在 7 天内提供了对脑缺血性损伤的显着保护,尤其是在第 3 天。因此,在该项研究中,研究人员专注于评估 EA 和 iPSC-EVs 治疗对 MCAO 动物的作用接受治疗3天。

 

中医理论认为,头部的GV20与大脑密切相关,常用于治疗脑部疾病。另一个穴位ST36被认为可以丰富身体的能量。GV20+ST36 的有效性可能主要归因于穴位的局部和远距离效应的结合。研究表明,ST36 处的刺激导致的脑电图和功能磁共振成像 (fMRI) 模式与针刺两个非穴位不同,而脑 fMRI 为穴位特异性提供了证据。目前的研究为穴位特异性提供了分子证据。

 

在这项研究中,研究人员将 iPSC-EV 注射到小鼠的尾静脉中,并研究了它们对有或没有 EA 刺激的小鼠大脑的损伤修复作用。单独的 iPSC-EV 和单独的 EA 均减少了 MCAO 小鼠的梗塞体积(TTC 染色)、增强的神经功能(Clark 评分)、改善的运动功能(圆柱试验和旷场试验)和抑制神经元凋亡(TUNEL 试验)。

 

此外,iPSC-EV 和 EA 的组合效果最好。研究人员认为,与单独使用 iPSC-EV 或 EA 相比,EA 与 iPSC-EV 的组合可能是一种更有效的修复脑损伤的方法。与以往的研究相比,EA 和 iPSC-EVs 的组合对缺血性损伤具有协同的神经保护作用。值得注意的是,所选穴位因疾病而异。

 

此外,电针对不同人群的作用受吸烟、肥胖、年龄和糖尿病等多种因素的影响。因此,在治疗不同的疾病时,电针的持续时间和作用机制也不同。

 

无疑,T淋巴细胞诱导的神经炎症与缺血性卒中密切相关。在其他研究中,脑卒中后 24 小时内浸润的 T 淋巴细胞在脑中增加,并在第 3 天左右达到峰值。Th1 和 Th2 之间的不平衡似乎是中风的一个关键因素。IL-17 水平升高和 Treg 数量减少与卒中发病直接相关。在该研究中,iPSC-EVs 和 EA 治疗通过促进 Treg 反应和抑制 Th17 和 Th1 反应来调节炎症反应。

 

穴位电针和 iPSC-EVs 治疗可以减少缺血性卒中小鼠的梗死体积、改善运动功能和神经功能,并抑制神经元凋亡。该研究结果揭示了 iPSC-EVs 和 EA 通过调节 IL-33/ST2 介导的炎症和小胶质细胞和星形胶质细胞的激活对缺血性脑损伤具有协同神经保护作用。该研究提出了一种新的缺血性脑损伤治疗方法,并为应用电针和iPSC-EVs联合治疗不同类型的组织损伤提供了研究基础。(本文由干细胞与外泌体编译,原为英文如编译有误请在评论区留言)

发布者:木木夕,转转请注明出处:https://www.cells88.com/linchuang/lcyj/10594.html

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