细胞重建角膜恢复视力:HCEnC产品介绍

简单的背景介绍,请看前文《干细胞重建角膜恢复视力:Holoclar产品介绍》,本文介绍另一种(干)细胞重建角膜的疗法,即人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cell,HCEnC)治疗。
 
眼球和角膜的解剖结构如下:

细胞重建角膜恢复视力:HCEnC产品介绍

 
据不完全统计,我国因角膜病致盲人数约有400多万,占全国致盲性眼病的第二位。但是大部分的角膜盲是可以通过角膜移植手术治疗。角膜移植手术面临的主要问题是供体材料来源严重匮乏,因我国国民受传统观念影响,捐献的角膜数量远远不能满足临床的需要。因此,科学家们在不断的探索研究,选择其他的角膜来源,用于角膜损伤的治疗。
 
目前,人角膜内皮细胞疗法(HCEnC疗法)仅在少数国家开发,包括日本、新加坡和美国。2021年日本一团队报道追踪角膜内皮细胞治疗术后5年的临床结果,11只眼中有10只眼的角膜内皮功能恢复正常,平均±标准偏差中心角膜ECD为1257±467个细胞/mm2(范围601-2067个细胞/mm2),10只眼的最佳矫正视力(BCVA)显著改善,未观察到与角膜内皮细胞治疗直接相关的重大不良反应[1]

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日本的团队于2018年发表在《新英格兰医学杂志》的临床研究,发现HCEnC联合前房注射rho相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂治疗大泡性角膜病,在细胞注射后24周,11只接受治疗的眼睛的HCEnC细胞密度超过500个细胞/平方毫米(范围947-2833),其中10只的HCEnC细胞密度超过1000个细胞/平方毫米,11只眼中有10只眼的角膜厚度小于630μm(范围489-640),11只眼中有9只眼的最佳矫正视力提高了两行或更多[2]
 
(1)HCEnC的原代分离
HCEnC的获得,通常需要通过角膜组织的机械剥离和酶消化,从供体角膜中分离出来HCEnC(称为单细胞培养法)。因此,在分离过程中,存在其他细胞类型,特别是基质成纤维细胞交叉污染的潜在风险。为了克服这个问题,可以考虑使用磁性细胞分离技术用于去除污染基质成纤维细胞[3],或选择性荧光激活细胞分选以从基质成纤维细胞中纯化和分离HCEnC[4],或者耗时更长的连续培养法[5]
 
已知供体年龄增加与增殖能力降低和细胞衰老相关,这可能影响HCEnC的总产量[6, 7]和供体角膜的利用率[8]。与年龄较大的供体(≥50岁)相比,HCEnC是从年轻供体(≤30岁)分离出来的HCEnCs具有较高的增殖能力[9]。几项研究表明,较年轻的供体HCEnC不容易发生细胞染色体异常(核型异常)[10-13]。鉴于核型异常与肿瘤发生之间的联系尚不清楚,因此建议尽可能从年轻供体获得原代HCEnC细胞。影响HCEnC细胞质量的还有供体的死亡原因[14-16]
 
与对照组的细胞相比,使用粘弹性溶液(Viscoat)的HCEnC细胞的融合率、细胞密度、六角型细胞形态、Ki-67阳性率和线粒体强度显著升高,而细胞面积和多态性显著降低[17]。加入热可逆凝胶聚合物(TGP)的新型角膜保存鸡尾酒来保持和运输角膜组织,有利于角膜组织细胞的后续培养,增强角膜内皮细胞密度维持和角膜缘细胞的外植体培养[18]
 
从供体角膜剥离Descemet膜的较慢速度可能会增加HCEnC的损失量[19]。在细胞分离之前,将供体Descemet膜内皮细胞(DM-EC)片放置在缺乏生长因子的稳定培养基中数天,可以增强HCEnC的增殖[20]
 
(2)HCEnC的扩增培养
到目前为止,主流两种体外HCEnC细胞增殖扩增技术,即单培养基和双培养基方法[21]。几个研究小组之前已经观察到HCEnC的增殖能力受培养基(包括生长因子和补充剂)的影响[22-24]。双培养基培养系统,即利用交替的高有丝分裂培养基(M4)和低有丝分裂培养基(M5),在第2代之后培养HCEnC,并保持所需的六角形细胞形态,显著扩大的HCEnC数量[25]。使用单一培养基的替代方法也被证明能产生高产量的均质HCEnC,包括:(i)基础培养基(含Opti-MEM1、FBS、生长因子和补充剂)、MSC条件培养基和Rock抑制剂 Y-27632的联合使用[12, 24];和(ii)补充激素上皮培养基(SHEM),由补充FBS、生长因子和补充剂的DMEM/F-12组成[26]。HCEnC还可以结合生物支架的3D打印技术来进行培养和移植治疗[27]

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HCEnC的转录组谱受培养环境所致的细胞有丝分裂速度的影响[23, 25]。与高促有丝分裂环境相比,低有丝分裂环境表现出更好的HCEnC形态,表达更多HCEnC特异性基因,并显示出更高的内皮细胞功能[23]。也许,在特定的培养体系下,某些生长因子在刺激HCEnC提高增殖活性的同时,增加了内皮细胞向间充质细胞转化(EMT)的发生。体外培养的HCEnC的增殖能力受细胞培养期间的接种密度的影响,接种密度>10000个细胞/cm2,能实现了更均匀的形态和更好的增殖潜能[28]
 
当然,HCEnC培养在各种生物材料的支架上面,甚至可以配合3D生物打印技术,形成移植治疗前的角膜[29]
 
(3)HCEnC的细胞学鉴定
健康人群的研究证明正常角膜内皮细胞的细胞形态(六边形)存在高度差异,表明六边形的细胞形态不是预测内皮功能的可靠参数[30, 31]。新加坡制定的HCEnC释放标准包括两种功能相关标记物(即Na+/K+ATP酶和ZO-1)的免疫组化检测,两种细胞表面标记物(即CD166和PRDX-6)的流式细胞术检测,以及基因表达标记物的聚合酶链反应(即COL8A2和SLC4A11)。
 
(4)HCEnC的储存和运输
储存或保存技术,包括温度、使用的储存介质和保存时间长度,已被证明会影响HCEnC的质量和内皮角膜移植术的成功[32-35]。因此,储存和运输的优化将变得至关重要,以使世界各地的其他国家都能获得这种新疗法。尽管低温是一种易于运输的储存方法,但研究表明,低温条件下培养的HCEnC的体外生存能力较差,可能与氧化应激和冷诱导损伤有关[35, 36]。HCEnC的储存后生存能力受多种储存因素的影响,包括培养基(Endo SFM优于Optisol-GS)、温度(4°C和37°C优于23°C)以及保存时间(2天优于4-6天)[37]。使用BiobankerhRM(一种低温保存试剂)在-80°C下储存HCEnC至少14天,同时在储存后保持约90%的细胞存活率[38]。这些技术可促进HCEnC的冷冻储存和运输,有利于实现HCEnC治疗的大规模商业化。
 
(5)HCEnC的产品释放标准
因此,有专家认为用于细胞治疗的理想HCEnC批次应满足以下产品释放标准:(1)具有典型六边形形态的足够数量的细胞和生存能力(限制在前3代内);(2) HCEnC相关生物标志物的表达;(3)明确定义和可量化的成分,包括内皮细胞、潜在杂质(如基质成纤维细胞等非理想细胞)和悬浮培养基(如维护、储存和运输培养基);(4)采用符合GMP的工艺制造;(5)无微生物污染(如细菌、支原体、真菌和病毒)[39]
 
 
参考文献:暂不提供
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