双特异性T细胞重定向与CAR-T细胞

介绍

癌细胞逃避免疫系统的主要机制之一是通过下调和丢失其主要组织相容性复合物I类 (MHC-I) 分子（又名人类白细胞抗原 (HLA)）。通常，MHC-I阳性肿瘤细胞会被具有识别MHC I类分子展示的肿瘤特异性肽的T细胞受体(TCR)的T细胞靶向。TCRs对癌细胞表面载肽MHCs (pMHCs)的识别和结合导致T细胞和癌细胞之间形成溶细胞性突触，导致细胞毒性蛋白，如穿孔素和颗粒酶的定向大量释放，以及克隆T细胞的活化和增殖。

在这种和其他突触相互作用中T细胞的最佳激活需要两个信号，TCR-MHC相互作用，称为“信号 1”和通过T细胞上的几种共刺激受体之一的共刺激信号（“信号 2”）（例如CD28、CD137、OX40、CD27、ICOS、GITR）及其同源配体（例如，CD80/86、CD137L、OX40L、CD70、ICOS-L、GITR-L）在靶细胞或专职抗原呈递细胞（APC) 。

第三个信号，免疫刺激细胞因子的产生，有助于驱动T细胞分化和扩增。基于MHC-I损失的肿瘤逃逸机制进一步复杂化，因为肿瘤细胞特异性新抗原通常是“最小的”或难以区分，因为它们可能只是与其野生型等位基因不同的单个残基，低MHC-I复合物的亲和力或表现不佳。

MHC-I分子的丢失或下调以及癌细胞中强肿瘤抗原的缺失使这些细胞能够逃脱肿瘤浸润性T细胞的识别和杀伤，而肿瘤浸润性T细胞是抗肿瘤免疫反应的关键组成部分。

此外，共刺激分子（例如，CD86、CD54）的丢失、检查点抑制分子（例如，PD-1、CTLA4）的过量产生以及色氨酸降解酶吲哚胺2,3-双加氧酶的肿瘤产生（IDO），它消除了色氨酸，色氨酸是T细胞增殖所需的一种关键氨基酸，是肿瘤利用机制逃避细胞毒性T细胞的其他例子。

今天，各种治疗策略试图以独立于TCR功能的方式利用T细胞的杀伤力，绕过HLA限制性抗原识别的限制。目前采用的两种最重要的基于TCR功能的T细胞治疗策略是T细胞重定向双特异性抗体(TRBA)和嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。

对于TRBA，分化簇 3(CD3)的ε(ε)结构域是TCR复合物的一个组成部分，它被一个结合（即结合）结构域靶向，而第二个结合结构域（因此，“双特异性”抗体）结合肿瘤细胞表面抗原（图 1B）。这些TRBA的作用是使T细胞和靶细胞靠近以形成溶细胞性突触，从而导致肿瘤细胞死亡。在嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的情况下，与T细胞激活细胞内结构域融合的癌细胞表面抗原靶向抗体片段在T细胞表面表达为新受体（图1D)。然后，这些识别肿瘤抗原的“武装”T细胞将识别、结合并杀死目标癌细胞。这两种策略都依赖于抗体来取代TCR的功能，使其独立于TCR及其同源MHC-I/肽识别，并且都可以用于识别和靶向MHC-I 领域之外的肿瘤特异性抗原-展示的新抗原肽。

图 1. 临床开发中基于T细胞的疗法的示例。 (A)抑制PD-1和CTLA-4等检查点受体以提高T细胞活性[18]； (B)双特异性抗体(TRBA)的T细胞重定向，其中一个结合臂识别肿瘤抗原，另一个结合臂识别T细胞上的CD3ε；(C)自体T细胞离体激活，结合双特异性抗体偶联物识别肿瘤抗原与一种mAb和T细胞上的CD3ε与另一种mAb，然后重新给药于患者以杀死肿瘤；(D)基因工程自体嵌合抗原受体(CAR)-T细胞，其中抗体，通常是单链可变片段(scFv)，与CD28、4-1BB、OX40 和CD3ζ等细胞内T细胞激活结构域融合，取代T 细胞受体(TCR)的功能，使T细胞成为特定抗原承载细胞的杀手；(E)用FcγRIIIa (CD16a)基因工程改造的自体或同种异体T细胞或NK细胞，当与抗肿瘤单克隆抗体(mAb)如抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗一起给药时，它们与抗体并在功能上将T或NK细胞重定向到肿瘤以杀死癌细胞；（F）具有工程化TCR的自体T细胞。

两种形式的治疗方法，即通过TRBA重定向T细胞以杀死肿瘤细胞和从患者T细胞中产生自体CAR-T细胞，在今天作为下一代抗肿瘤生物疗法提供了巨大的希望。这些方法也被用作潜在的抗病毒疗法。

截至2019年6月20日，两种基于T细胞的方法已获得主要监管机构的批准。总之，至少有289种独特的T/NK细胞重定向治疗候选药物，包括61种不同的TRBA、225种独特的CAR-T和三种用CD16a转导的T/NK细胞，目前正在超过320项独特的临床试验中进行测试（表1）。此外，利用基于这两种主要T细胞治疗策略的概念的其他治疗方法也在临床试验中进行测试（图1）。目前批准的数量已远远超过这个数量。

1. T细胞重定向双特异性抗体简史

1970 年代中期的两项基本发现最终导致了基于TCR功能的治疗方法的概念治疗至少某些形式的癌症的最有希望的范例。其中第一个是著名的诺贝尔奖获得者，Köhler和Milstein发现了从杂交瘤中制备和表征单克隆抗体的方法。第二个是基本观察，活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以作为靶向癌细胞的连环杀手 ，通过与靶细胞形成免疫突触，然后脱粒和释放溶细胞穿孔素和颗粒酶等蛋白质。这些和其他早期研究最终导致了TRBA的发展，以接合和重定向T细胞以诱导抗原特异性靶向癌细胞的连续杀伤以及自体T 胞的基因工程以赋予它们癌症能力细胞表面抗原特异性靶向抗体受体（即 CAR）与T细胞激活结构域融合。

在最初从免疫小鼠中分离出单克隆抗体(mAb)的十年内，第一个双特异性抗体是使用多种方法产生的，包括杂交杂交瘤、两种全长IgG的化学缀合和Fabs ，使用硫氢键的还原和氧化过程形成双特异性 F(ab')2抗体以及基于单链变量制造双特异性抗体片段的重组方法片段（scFvs）。

今天，在T细胞重定向双特异性抗体和CAR-T细胞的海啸中，或许没有得到充分的重视，这是第一个通过将一个抗体重组（或结合）位点与 T 细胞表面标志物结合以杀死被结合的肿瘤细胞来重定向T细胞的概念和实践。其他重组位点在1985-1986年的几篇论文中进行了阐述。此后不久，即1987年，首次描述了使用TCR的 CD3成分作为T细胞靶标进行重定向。

图 2 列出了T细胞重定向双特异性抗体和CAR-T疗法的简史。1990年代的几项关键进展为今天用于临床阶段候选抗体的多种T细胞重定向双特异性抗体形式奠定了基础。第一次给药T细胞重定向双特异性抗体的临床试验是在1990年，当时患有胶质母细胞瘤的患者接受了与抗胶质瘤抗原IgG化学偶联的抗CD3 IgG。紧随其后的是抗CD19×抗CD3双特异性IgG样大鼠/小鼠杂交双特异性抗体的产生并在临床研究中用于治疗B细胞淋巴瘤。该抗体是第一个在临床试验中研究的靶向恶性B细胞的IgG样T细胞重定向双特异性抗体。

图 2. T 细胞重定向双特异性抗体（TRBA；上）和嵌合抗原受体（CAR）-T细胞（下）疗法历史上的关键里程碑。TRBAs引用的具体参考文献有：Milstein和Cuello，1983；Staerz 等人，1985；Clark和Waldmann，1987；Nitta等人，1990；Haagen等人， 1992；De Gast 等人，1995；Mack 等人，1995；Ridgeway等人，1996；Zeidler等人，1999和Löffler等人, 2000。引用的CAR-T开发的具体参考文献有：Rosenberg et al., 1988, Gross et al., 1989, Eshhar et al., 1993, Hwu et al., 1993和Moritz等人1994。

1980年代后期和1990年代的另一个重大进展是发现了通过Fv的两个结构域，可变重(VH)和可变轻(VL)结构域连接在一起来生成单链可变片段(scFv)抗体构建体的方法。短的柔性接头，然后通过肽接头将两个scFv融合在一起以产生第一个双特异性T细胞接合剂(BiTE®)样抗体（图 2）。第一个BiTE®用一个scFv靶向靶细胞上的肿瘤抗原17-1A，另一个scFv臂靶向T细胞上的CD3。

抗CD19×CD3 BiTE®的首次描述是在2000年。1990年代最后的重大进步是由Genentech的科学家产生了现在众所周知的不对称异二聚体Fc平台“knobs-into-holes”(KIH)（图 2）。该平台成为整代IgG样不对称双特异性抗体的原型，该抗体在CH3结构域中进行修饰，以形成异二聚体抗体。

在设计具有两条重链的生产细胞系后，一条具有“旋钮”或突出的氨基酸残基，在CH3结构域的界面区域发生突变，另一个具有补偿性“孔”或小氨基酸残基突变和两个轻链链，由此产生的异二聚体可以在四种可能的HC-LC配对中形成，其中所需的形式只是抗体分子之一。该技术随后通过使用常见的LC得到改进，以消除“轻链问题”，即轻链与正确的Fc半配对。

然而，有趣的是，在Merchant等人之后的十年的论文中，双特异性抗体工程几乎没有取得任何进展，并且大部分活动仅集中在两个临床候选者上。然而，从大约 2007-2009年开始，人们对开发新的双特异性抗体平台并使用这些平台制造TRBA和其他双特异性抗体疗法的兴趣猛增，导致开发了超过100种不同的新平台。

第一个被主要监管机构批准用于商业用途的TRBA和双特异性抗体是catumaxomab（商品名Removab®），这是一种杂交的小鼠-大鼠IgG样双特异性抗体，靶向T细胞上的CD3ε，单臂和癌症抗原，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，与另一臂。Catumaxomab似乎在2001-2002年期间首次进入临床试验，于2009年被欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗恶性腹水。然而，由于其在人类中的高免疫原性（作为一种完全啮齿动物的抗体）、狭窄且罕见的批准适应症（即恶性腹水）以及随后的销售不佳，Removab®在2014年之后并未积极上市，并在2014年被其赞助商自愿停产。2017年，Removab®从未获得美国食品和药物管理局(US-FDA)的批准。

第二个被批准用于治疗用途的T细胞重定向抗体是blinatumomab（商品名Blincyto®），一种基于片段的双特异性抗体，称为BiTE®，其中两个单链可变片段(scFvs)，一个靶向B细胞抗原、CD19和其他CD3ε用一个短的、五个残基(G4S)1接头连接在一起，即：((VLCD19-(GGGGS)3-VHCD19)-GGGGS-(VHCD3-(GGS)4GG-VLCD3ε)) 。Blinatumomab最初被称为Micromet MT103（又名MedImmune MEDI-538），于2006年首次进入临床试验。Blincyto®于2014年获得美国FDA批准，用于治疗费城染色体阴性B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL)，使其成为第二个被批准用于治疗用途的TRBA。

在2008年的时间范围内，仅在临床试验中研究了三种TRBA（catumaxomab）、blinatumomab和ertumaxomab，一种针对HER2的大鼠/小鼠TRBA，现在有59个独特的临床候选CD3ε结合TRBA要么已获监管机构批准，要么正在临床试验中研究，另外两个重定向NK细胞，总计61个TRBA（表 1）。

2. CAR-T细胞简史

1970年代后期的研究清楚地表明，CTL能够连续杀伤靶向癌细胞 。这一概念在逻辑上导致了利用自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的力量来治疗它们来源的肿瘤的想法。对于这种方法，从人类肿瘤中采集TIL，离体扩增4到8周，然后与一定剂量的白细胞介素2 (IL-2) 一起静脉内重新给药，以帮助刺激重新给药的淋巴细胞。这种治疗导致60%接受治疗的患者的转移性肿瘤消退。虽然这些结果是初步的，但它们清楚地证明了肿瘤特异性、扩增和活化的自体T细胞在癌症治疗中的潜在用途。

然而，使用自体TILs作为治疗剂仍然缺乏强大的肿瘤靶向性和控制靶向哪些细胞的能力。1989年，Gross等人报道了第一个成功的具有已知和特异性人工结合能力的T细胞工程（图 2）。将抗 2,4,6-三硝基苯酚(TNP)抗体的VH和VL链融合到TCR生成人工嵌合TCR。以这种方式改造的T细胞能够以非MHC限制的方式杀死TNP包被的靶细胞。虽然这种工程细胞结构本身并不是我们今天所想的CAR-T细胞，但它直接导致了第一代CAR-T细胞的形成。

第一个靶向半抗原TNP的CAR由直接与人Fc受体γ链融合的scFv (VL-linker-VH) 组成，充满了其短的细胞外结构域、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)（图 3）。CD3ζ链在序列和功能上与 γ 链高度相似，也被用作融合中的细胞内信号结构域。这些第一个 CAR-T细胞是用由抗体组成的CAR构建T细胞。

虽然CAR-T细胞的概念自1990年代初就已经存在，但仅在过去十年中，技术才发展到将其转变为可行的“可制造”过程所需的程度。因此，类似于TRBA方法，CAR-T在概念上是古老的，但在功能上仍然相对年轻且正在发展。

图 3. CAR-T 细胞疗法的代次。文中描述的几代CAR-T细胞疗法。(A)CAR-T的概括图，显示了 cFv与跨膜域和细胞内激活域的融合。(B)描绘文本中描述的第一代、第二代和第三代CAR-T结构示例的绘图。

CAR-T细胞工程最早的“真正”癌症靶点之一是细胞表面叶酸结合蛋白（后来被确定为叶酸受体(FR)），它被认为是卵巢癌的靶点。如上所述（图 3），通过将源自抗FR抗体MOv18的scFv与Fcγ链融合构建了第一代抗FR CAR。用这种CAR（命名为Mov-γ）转导的T细胞在体外杀死了FR+ IGROV-1卵巢腺癌细胞并增加了植入IGROV-1卵巢腺癌细胞的小鼠的存活率。该结构随后被用于自体CAR-T治疗卵巢癌患者的早期临床试验之一。由于第一代设计有限，使用Mov-γ CAR-T治疗导致缺乏CAR-T持久性、向肿瘤部位的运输不良，并且没有减少任何患者的肿瘤负担。在同一时期，莫里茨等人使用靶向HER2的CAR-T细胞系进行了首次临床前体内研究（图 2）。

使用CAR-T细胞进行临床试验的前两份报告发表于2000年（图 2）。三泰等人描述了用CAR治疗HIV感染患者的方法，该CAR由人CD4的细胞外和跨膜结构域与CD3ζ的细胞内结构域融合，导致一些患者的病毒滴度暂时下降。此外，Junghans 等人报告了一项临床试验的结果，其中癌症患者接受了针对癌胚抗原(CEA)的CAR治疗。Eshhar回顾了使用CAR-T细胞的其他早期临床研究。

第二代 CAR-T 细胞的设计是通过向γ链或CD3ζ CAR构建体添加来自共刺激受体的细胞质信号结构域，例如CD28、4-1BB (CD137)或OX40 (CD134) (图 3)。这些构建体通常会导致活化细胞因子（如 IL-2 和 IFN-γ）的产生增加，增加抗原依赖性体外增殖和上调凋亡因子（如 Bcl-XL）。然而，即使使用第二代CAR T细胞激活似乎仍未完成 。因此，设计了一系列第三代CAR，并开始将其纳入今天的临床试验。第三代CAR结合了CD28的内部结构域以及来自OX40 (CD134)或 4-1BB (CD137)的细胞内信号结构域（图 3），从而产生具有增殖和增强能力的溶细胞性T细胞。增强它们的细胞杀伤活性和它们在循环中的持久性的生存信号。

随后，证明最佳CAR活性需要更长、更灵活的“铰链”区域（即细胞外间隔区，例如来自IgG-Fc或CD8α的区域）（图 3），并且从那时起多年来，已经做出了重大努力来优化细胞外间隔物的长度和结构特征。

似乎很明显，向CAR添加更多的T细胞激活信号会导致更强大的肿瘤细胞杀伤。尽管某些研究表明情况确实如此，但仍不清楚在每种情况下“越多越好”。各种体外和体内研究已经描述了依赖于CAR设计的工程化T细胞功能的改进和局限性。T细胞耗竭和无能，以及肿瘤微环境对T细胞通常产生的负面影响，涉及T细胞内精心编排的一系列信号，这些信号目前尚不被CAR工程所理解且不易适应。同样，CAR分子结构的微调也被认为是一个需要改进的领域，因为完整的 T 细胞受体复合物的复杂物理化学性质开始被揭示。

Bispecific T-Cell Redirection versus Chimeric Antigen

Receptor (CAR)-T Cells as Approaches to Kill Cancer Cells

Antibodies 2019, 8, 41; doi:10.3390/antib8030041