CAR-NK用于肿瘤免疫治疗的临床转化

自然杀伤 (NK) 细胞被认为是修饰 T 细胞的替代品，因为NK细胞固有地缺乏这些缺点。CAR-NK细胞疗法比CAR-T细胞疗法更安全，正在成为肿瘤免疫领域的研究热点。同种异体NK细胞移植几乎不会诱发移植物抗宿主病(GvHD)。此外，NK 细胞来源广泛，例如外周血(PB)、脐带血(UCB)、人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞 (hiPSC)和NK细胞系。NK 细胞分泌IL-3和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，因此不太可能引起CRS。NK细胞分泌的 PD-1 水平显着降低，几乎不会引起免疫抑制，这使得NK细胞成为对抗实体瘤的良好候选者。此外，NK细胞促进树突状细胞迁移到肿瘤中，从而增强抗PD-1免疫治疗。因此，NK细胞在杀伤肿瘤方面发挥着重要作用。CAR-NK细胞疗法已在临床前和临床试验中证明可以杀死血液和实体肿瘤细胞，证明其作为具有广泛临床应用的现成产品的潜力。

本综述侧重于从临床前到临床的转化、提高治疗安全性和有效性的新策略，并描述了CAR-NK细胞治疗的挑战。

CAR-NK细胞的构建与机制

CARs的设计必须考虑到NK细胞的独特特性，才能进行CAR-NK细胞治疗。DNAX激活蛋白(DAP) 12在NK细胞上表达并参与NK激活受体自然杀伤组2(NKG2)成员C和 NKp44的信号转导。托普弗等人报道，具有DAP12细胞内结构域的CAR在启动下游信号方面与CD3ζ-CAR一样有效。

在另一个NK激活受体NKG2成员D(NKG2D)连接后，信号转导通过DAP10的磷酸化发生，这反过来又招募下游信号效应分子，并最终导致NK细胞分泌细胞因子。这些表达CAR的NK (NKG2D-DAP10-CD3ζ) 细胞对ALL、骨肉瘤和前列腺肿瘤具有很强的抗肿瘤作用。

CAR-NK细胞不仅通过CAR特异性识别表达抗原的肿瘤的能力，而且通过NK细胞受体本身来消除肿瘤。决定NK细胞活性的是刺激和抑制信号的平衡，而不是抗原特异性。这些信号激活衔接蛋白，释放穿孔素和颗粒酶，并控制细胞因子的产生。Caspase诱导的细胞凋亡是由NK细胞上的FasL与肿瘤表达的配体之间的相互作用引起的。NK细胞的另一种杀伤机制涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。

因此，CAR-NK细胞的靶向裂解是基于CAR依赖性和NK受体依赖性机制，并且裂解也适用于具有抗原阴性膜的肿瘤。

CAR-NK细胞治疗肿瘤的临床前成果

最近，CAR修饰的NK-92和原代NK细胞的作用正在血液肿瘤和实体肿瘤中得到广泛研究。

（1）血液肿瘤的临床前研究

Romanski等人构建的NK92-CD19-CD3ζ细胞。增强NK细胞的敏感性及其对B系恶性细胞的细胞毒性。Shimasaki等人将CD19-41BB-ζ mRNA转染到NK细胞中。并且被发现用电穿孔技术稳定表达，随后光学体内成像显示，异种移植白血病的生长速度在接受CAR-NK细胞治疗后显着减慢。Chu等人使用核转染技术，通过与K562-mb-IL15-41BBL 培养，用CD20-BB-ζmRNA和活化的CAR-NK细胞修饰PB-NK细胞，从而增强对利妥昔单抗耐药伯基特淋巴瘤的细胞毒性并延长小鼠的存活时间。CD138-CAR-NK-92还延长了多发性骨髓瘤(MM)小鼠模型的存活率。有趣的是，CAR-NK92细胞靶向非肿瘤靶点EBNA3C，有效消除Epstein-Barr病毒阳性 T 细胞，展示了它们的巨大潜力（表 1）。

（2）实体瘤的临床前研究

CS1-CD28/CD3ζ-NK92抑制MM生长，促进IFN-γ分泌，延长荷瘤小鼠的生存期。韩等人构建了具有表皮生长因子受体（EGFR）-CD28-CD3ζ的CAR-NK-92细胞，对胶质母细胞瘤（GBM）细胞具有很强的杀伤作用。GD2特异性 NK-92 [34] 细胞靶向神经母细胞瘤并发挥细胞溶解作用。在骨肉瘤、肝细胞癌 (HCC)、胰腺癌和乳腺癌中观察到 NKG2D-DAP10-CD3ζ 具有很强的抗肿瘤作用。前列腺干细胞抗原 (PSCA)-DAP12-CAR 被转染到 PB-NK和YTS-NK细胞中，使它们对PSCA+肿瘤具有溶解作用。

CAR-iPSC-NK细胞显着抑制小鼠异种移植卵巢癌的生长。源自iPSC的NK细胞可以作为标准化产品大规模生产，这将允许它们通过重复注射以多剂量给药，从而更有效地治疗难治性实体瘤与化疗相结合（表 2）。

CAR-NK细胞疗法在血液和实体瘤中的临床转化

200项关于CAR-T细胞的研究已在clinicaltrials上注册。然而，只有9项临床试验（表 3）涉及来自原代NK细胞和NK细胞系的CAR-NK细胞（图 1）。

进行了六项临床试验以评估CAR-NK92细胞疗法的安全性。CD19、CD7和 CD33 靶向淋巴瘤和白血病（NCT02742727、NCT02892695、NCT02944162）。HER2靶向 GBM(NCT03383978)，共刺激转化受体靶向非小细胞肺癌(NSCLC) (NCT03656705)。粘蛋白 1 (MUC1)靶向多种难治性实体瘤，包括HCC、NSCLC、胰腺肿瘤和三阴性浸润性乳腺肿瘤(NCT02839954)。

唐等人将 CD33-CAR-NK92细胞注射到10名复发或难治性AML患者体内 [39]。每位患者安全给药一剂5×109个CAR-NK92细胞，然后可以在PB中检测到。只有3名患者在治疗后出现轻度发热和CRS，并于次日恢复正常（NCT02944162）。

图 1. CAR-NK过继细胞疗法 (ACT) 在癌症患者中的临床应用程序。

已有三项关于源自PB或UCB的CD19-CAR-NK细胞的临床试验。在圣裘德儿童研究医院进行的临床试验 (NCT00995137) 招募了14名18岁以下的患者。用CD19-41BBz-CAR转染的半相同PB衍生NK细胞通过与辐照共培养进行扩增K562-mb15-41BBL。另一项临床试验（NCT01974479）目前正在美国国立大学卫生系统进行。NK细胞用抗CD19-BB-zeta mRNA转染儿童和成人的难治性ALL，剂量为（0.5-1）×108/kg。v. 第三次试验(NCT03056339)在MD Anderson癌症中心进行。来自UCB的NK细胞用含有 iCasp9/IL-15自杀基因的CAR转染，分泌IL-15以支持生存，并表达自杀基因以在药理激活时消除自身。幸运的是，这种疗法在 2017年获得了批准用于B细胞淋巴瘤的 I/II 期试验。

CAR-NK细胞疗法面临的改进和挑战

（1）CAR-NK细胞疗法的改进

迄今为止，已经在多种肿瘤模型中对CAR-NK细胞疗法进行了广泛的临床前研究。患者来源的肿瘤异种移植(PDX) 模型保留了原发性肿瘤的异质性，是临床癌症的优秀模型，因为它直接将肿瘤从患者转移到NSG或NOG小鼠。大多数CAR-NK细胞疗法已在临床前试验中评估了PDX模型的疗效，包括针对血液肿瘤靶标（例如CD19、CD20、CD138和CS-1）的CAR和实体瘤（例如，HER2、GD2、PSCA和 EGFRvIII）。

与PDX相比，人源化小鼠是更准确的模型。它们是通过将人类造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，使其发展出人体免疫系统而产生的，克服了PDX模型无法观察到CAR-NK/T对宿主免疫细胞TME的影响。CD44v6-CAR-T细胞被移植到人源化小鼠体内，以评估它们对造血干细胞的靶向/非肿瘤毒性。此外，还评估了分泌抗程序性死亡配体 1 (PD-L1) 抗体的碳酸酐酶IX-CAR-T细胞对人源化小鼠肿瘤部位募集NK细胞的影响。

（2）挑战和应对策略

尽管CAR-NK细胞疗法具有巨大潜力，但仍有一些基本问题需要解决以扩大其临床应用。首先，目前的CAR是为构建CAR-T细胞而设计的，因此，对于应用于 NK 细胞而言，它不是最佳选择。CAR结合表位的位置及其与CAR-NK细胞表面的距离会影响它们结合抗原和激活CAR-NK细胞的能力。李等人构建了九个专门针对NK细胞杀死黑色素瘤的 CAR，特别关注细胞内刺激衔接分子，以找到针对 NK 细胞活化和细胞毒性的优化CAR构建体[45]。

其次，逆转录病毒转染可能诱导插入突变，慢病毒转导效率对PB-NK细胞低。非病毒载体克服了这些缺点，被认为是一种安全且负担得起的转导替代方案 。即使在原代静息NK细胞中，在mRNA电穿孔后24小时CAR表达为82.0%。

第三，NK细胞对冻融过程很敏感。解冻后NK细胞的存活率和细胞毒性显着降低。一些团队发现冷冻NK细胞的活性可以通过添加IL-2来部分恢复。必须探索最佳冷冻保存策略，以使 AR-NK细胞疗法作为现成产品可行。

最后，同种异体 NK 细胞可能被T细胞污染，导致GvHD或淋巴增殖性疾病 。前淋巴细胞缺失可能会完全去除T细胞。此外，调节性T细胞和髓源性抑制细胞也受到影响，这在NK细胞治疗中起负面作用。另一种方法是建立最佳的临床级方案，用于纯化最终对患者安全的NK细胞。

提高安全性和有效性的新策略

（1）提高CAR-NK细胞治疗的安全性

将自杀基因整合到CAR结构和双特异性CAR分子可用于提高CAR-NK细胞治疗的安全性。1990年代干细胞移植后首次使用HSV-TK/GCV自杀系统。Fas和caspase 9等凋亡途径已被使用。目前，含有自杀基因的GD2-CAR-T细胞（NCT01822652）用于治疗肉瘤和神经母细胞瘤的I期临床试验正在进行中。CAR 掩蔽肽由阻断抗原结合位点的掩蔽肽和蛋白酶连接组成。当蛋白酶切割的连接与TME中的掩蔽肽分离时，CAR-T 细胞可以在局部肿瘤部位保持活跃。氧敏感CAR 是通过将 HIF1的氧敏感子域与CAR结构融合而设计的。

此外，CAR-T被设计为在SynNotch和CAR配体在肿瘤上共表达时激活，这是一种空间识别和有效控制CAR-T细胞激活的策略。

（2）提高CAR-NK细胞治疗的疗效

在CAR-NK细胞的设计过程中沉默NK抑制受体使它们对肿瘤更具抵抗力。当 IL-4和IL-7受体结构域与反向细胞因子受体(4/7 ICR)融合并添加到CAR构建体中时，一些研究小组发现源自肿瘤的 IL-4 的抑制作用降低，增殖促进了CAR-T细胞的发展。CAR/ICR转染的T细胞在体内含有IL-4的TME中发挥持续的抗肿瘤作用。考虑到CAR-NK细胞的特异性，ICR受体（IL-15、IL-21）是否适用于CAR-NK细胞的策略需要进一步确定。有趣的是，CAR-T/NK 细胞维持着固有的代谢过程。以 4-1BB作为共刺激分子的CAR-T细胞依赖于氧化代谢，增强 T 细胞的线粒体活性、增殖和持久性，并增强抗PD-1活性。因此，可以通过调节CAR-T/NK细胞的代谢来提高治疗效果。

随着未来几年提供更多的临床数据，CAR-NK细胞疗法可能会导致肿瘤免疫疗法的革命性进展。